用于保持组织样本高细胞活性的保存液及保存方法技术

本发明专利技术提供了一类用于保持组织样本高细胞活性的保存液及保存方法，其中保存液成分包括离子缓冲液成分、糖类化合物成分、避免0‑6℃低温条件下组织细胞内外溶液产生冰晶的成分、为组织细胞合成代谢提供补充的成分、抗氧化和抗细胞凋亡成分，具有较好的生物相容性，无有毒有害成分。同时不含有动物源蛋白、抗生素和激素类等影响组织基因表达的成分。区别于传统的超低温冻存（‑80℃），本发明专利技术可有效实现人和动物的新鲜组织样本的低温存储（0‑6℃），保持组织具有较高的细胞活性，维持组织形态，用于组织样本的保存和运输。同时本发明专利技术可以有效保持组织的核酸完整性和基因表达的稳定性，保持组织的原始状态，可用于基因检测和科学研究等相关实验。

【技术实现步骤摘要】
用于保持组织样本高细胞活性的保存液及保存方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及用于维持人或动物的新鲜组织样本细胞存活的保存液，并且不改变组织样本的基因表达；尤其涉及一种用于保持组织样本高细胞活性的保存液；此外，本专利技术还涉及使用该保存液的保存方法。
技术介绍
随着基因检测技术的快速发展与普及，如何安全、有效的保存采集到的生物样本成为关键。新鲜组织样本的采集到实验室检测，存在着时间和空间的距离，如何保证组织样本在这一过程中维持细胞的活性及基因表达的稳定性，将决定实验结果是否准确有效。尤其是目前基因检测领域中的研究热点单细胞测序技术等，对于组织样本的保存有着更高的要求。与传统的基因检测技术不同，单细胞测序能够独立地分析每个细胞的核酸的表达，并且可以鉴定分别异质细胞群中稀有个体。这一过程要求组织样本的细胞活性一般不低于80%，从而避免细胞死亡后造成的核酸降解、基因信息的丢失，同时要求组织样本能够消化成单细胞悬液。而空间转录组测序不仅要求组织细胞的核酸不降解，并且要求组织的结构完整，从而确定不同细胞在组织中的空间位置。目前临床组织样本的保存一般采用化学固定，例如甲醛固定或超低温（-80℃）冻存的方式。然而这样的保存方式会造成组织细胞核酸的降解，有研究表明传统的冻存样本会造成转录组的完整性和细胞群类异质性的降低，从而影响临床检测或基础研究得到实验数据的可靠性。通过甲醛固定后的组织样本，一方面会有明显的RNA降解；另一方面由于组织的化学交联，无法消化处理制备成单细胞悬液，用于单细胞测序实验等。同时超低温冷冻保存（-80℃）的组织在冻存和复苏的过程中，会造成大量的细胞损伤。因此在组织样本的采集、运输到实验室检测过程中，需要保存介质和相应的保存方法维持组织细胞的活性、核酸的完整性和基因表达的稳定性。而低温条件下，例如0-6℃条件下保存在适当的保存液中可以达到保持组织细胞活性、降低细胞新陈代谢，保持基因表达稳定的效果。例如器官移植使用的保存液，可保持器官的活性和移植后的生理功能。但目前器官移植使用的保存液等对于组织的保存时间较短；同时器官保存液中包含激素成分，例如地塞米松、前列腺素等会对保存的组织细胞产生刺激，从而对组织细胞基因水平上的产生影响，造成基因表达的改变，影响下游基因检测和研究，例如严重影响单细胞转录组测序的实验结果。而一些传统的组织保存试剂通过加入动物源蛋白，例如牛血清白蛋白等，都会对组织细胞的基因表达造成潜在的影响。目前对于细胞的保存可以实现在适当的保存液中超低温冻存或低温保存等，并且针对不同的细胞有不同优化的保存介质和方法。但相比于细胞，组织的细胞成分复杂，是由多种类型细胞构成。组织的保存介质需要对多种不同类型的原代细胞都具有较好的保存效果。并且由于组织结构紧密，保存介质不易渗透到组织的细胞中。而在提高保存介质组织渗透性的同时，又不能破坏组织的空间结构和形态，相比细胞的保存，实现组织的保存难度更大。由于组织样本与器官、细胞样本等存在着体积大小、细胞种类、胞外渗透压和离子通透性的差异。因此亟待针对性的设计、开发用于新鲜组织样本的保存试剂，在低温条件下保持组织具有较高的细胞存活率，具有较高的渗透性和组织穿透能力，能适应与多组分细胞的保存，并且维持组织的空间结构形态，同时不改变细胞的基因表达，解决新鲜组织样本的保存与运输。中国专利技术专利申请CN108935444A公开了一种RNA样本保存液及其应用方法。虽然可以保持样本的RNA不被降解，但配方中的高盐溶液会造成细胞脱水而死亡。一方面在细胞死亡过程中造成细胞的应激性反应，产生基因表达的改变。另一方面细胞膜的通透性改变，细胞质内的RNA会游离到溶液体系内，造成细胞基因信息的丢失。而在一些基因检测实验中，例如单细胞转录组测序，是根据单个细胞的RNA信息对细胞进行聚类分析，需要保证每个细胞RNA信息的完整性。中国专利技术专利申请CN108184814A公开了一种样本保存液及制备方法和应用。通过醇类的脱水作用和甲醛的交联作用，将组织形态进行固定，此时组织细胞处于死亡状态，同样会造成细胞质核酸的游离到细胞外，造成基因信息的丢失。同时固定的组织细胞由于处于交联状态，无法重新消化制备单个的细胞悬液用于单细胞测序。更重要的是，保存液中没有对核酸保护的成分，会造成核酸的降解，不能用于基因检测等核酸相关的生物学研究。中国专利技术专利申请CN107183012A公开了一种人体干细胞的冷冻液及冷冻存储方法，是采用超低温冷冻（-80℃）和液氮的保存方式。但仅可用于细胞的保存，无法保存组织。而对于冻存的保存方式，文献报道了超低温冻存的样本用于单细胞测序实验检测会造成转录组的完整性和细胞群类异质性的降低。同时该专利技术的必要成分中的DMSO、甘油等在低温条件（0-6℃）和常温条件都会对细胞产生毒性。因此细胞复苏的过程中容易造成组织细胞的死亡。必要成分中的动物源蛋白一方面会将样本中引入动物源的污染，另一方面会对组织细胞的基因表达造成改变。以上三项专利技术专利申请中的保存方法都不能实现保持组织的具有高细胞活性和基因信息的完整，同时不改变组织细胞基因的表达。因此，亟需研发一种新的用于组织样本的保存液及保存方法，以实现保持组织样本具有高细胞活性和基因信息的完整，维持组织的空间结构，同时不改变组织细胞基因的表达。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一，为了解决新鲜组织样本采集后保存与运输，保持组织的高细胞活性和基因信息的完整，不改变组织细胞的基因表达，本专利技术提供了一种用于保持组织样本高细胞活性的保存液。该保存液采用低温保存的方式（0-6℃），可以降低组织细胞的新陈代谢速率，维持细胞活性的同时可以降低细胞基因表达的改变，使细胞保持在初始的状态。但是低温条件细胞内外溶液中的水分易形成冰晶，对细胞膜造成破坏。同时长时间的低温保存会引起组织细胞的自由基的产生和细胞凋亡通路的激活等。因此需要相应的低温保存介质维持组织细胞内外渗透压、细胞膜稳定性、避免溶液中冰晶的生成、维持组织细胞基本的生理代谢所需的物质及抗氧化和抗细胞凋亡等。同时保存介质中不能含有可维持组织细胞活性，但可能会引起基因表达改变的成分，例如激素类成分（地塞米松、前列腺素、胰岛素）、抗生素类成分（青霉素）和动物源蛋白（牛血清白蛋白、人血清白蛋白）等。本专利技术要解决的技术之二是提供使用该保存液的保存方法。本专利技术要解决的技术问题之三是提供该保存液的用途。在本专利技术的第一方面，提供了一类保存液，用于新鲜组织样本的低温保存（0-6℃），其中包括离子缓冲液成分、糖类化合物成分、避免低温条件下细胞内外溶液产生冰晶的成分（所述低温条件为0-6℃）、为组织细胞的合成代谢提供补充的成分、抗氧化和抗细胞凋亡成分等。所述离子缓冲液成分是指维持组织细胞渗透压的盐离子浓度和维持生理环境pH稳定的缓冲液成分。离子缓冲液成分包括氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、碳酸二氢钠、磷酸氢钾、碳酸氢钾、磷酸二氢钾、碳酸二氢钾、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三（羟甲基）氨基甲烷等中的一种或几种，溶液的pH范围在7.0-7.6。所述糖类化合物成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于保持组织样本高细胞活性的保存液，其特征在于，所述保存液包括如下成分：离子缓冲液成分、糖类化合物成分、避免低温条件下组织细胞内外溶液产生冰晶的成分、为组织细胞的合成代谢提供补充的成分、抗氧化和抗细胞凋亡成分；所述低温条件为0-6℃；/n所述离子缓冲液成分选自氢氧化钠、氢氧化钾、氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、碳酸二氢钠、磷酸氢钾、碳酸氢钾、磷酸二氢钾、碳酸二氢钾、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三（羟甲基）氨基甲烷中的一种或几种，所述离子缓冲液成分的溶液pH值范围在7.0-7.6；/n所述糖类化合物成分选自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、乳糖酸、棉子糖、海藻糖、麦芽糖、葡聚糖、羟乙基淀粉、水溶性淀粉等单糖、二糖、三糖及多糖类化合物中的一种或几种；/n所述避免低温条件下组织细胞内外溶液产生冰晶的成分选自葡聚糖、羟乙基淀粉、水溶性淀粉、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种；/n所述为组织细胞的合成代谢提供补充的成分选自腺苷等核苷、腺苷酸等核苷酸、甘氨酸等氨基酸中的一种或几种；/n所述抗氧化和抗细胞凋亡成分选自还原型谷胱甘肽、维生素C、维生素D、水溶性维生素E、别嘌呤醇、N-乙酰半胱氨酸中的一种或几种。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于保持组织样本高细胞活性的保存液，其特征在于，所述保存液包括如下成分：离子缓冲液成分、糖类化合物成分、避免低温条件下组织细胞内外溶液产生冰晶的成分、为组织细胞的合成代谢提供补充的成分、抗氧化和抗细胞凋亡成分；所述低温条件为0-6℃；
所述离子缓冲液成分选自氢氧化钠、氢氧化钾、氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、碳酸二氢钠、磷酸氢钾、碳酸氢钾、磷酸二氢钾、碳酸二氢钾、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三（羟甲基）氨基甲烷中的一种或几种，所述离子缓冲液成分的溶液pH值范围在7.0-7.6；
所述糖类化合物成分选自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、乳糖酸、棉子糖、海藻糖、麦芽糖、葡聚糖、羟乙基淀粉、水溶性淀粉等单糖、二糖、三糖及多糖类化合物中的一种或几种；
所述避免低温条件下组织细胞内外溶液产生冰晶的成分选自葡聚糖、羟乙基淀粉、水溶性淀粉、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种；
所述为组织细胞的合成代谢提供补充的成分选自腺苷等核苷、腺苷酸等核苷酸、甘氨酸等氨基酸中的一种或几种；
所述抗氧化和抗细胞凋亡成分选自还原型谷胱甘肽、维生素C、维生素D、水溶性维生素E、别嘌呤醇、N-乙酰半胱氨酸中的一种或几种。


2.如权利要求1中所述的保存液，其特征在于，所述离子缓冲液成分为0.8-1.2g/L氢氧化钠、5-6g/...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘崇懿，李婷婷，孟宪欣，肖华胜，
申请(专利权)人：上海伯豪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31