一种用于皮肤组织解离的混合酶及其制备方法、解离试剂盒、解离方法技术

本发明专利技术公开了一种用于皮肤组织解离的混合酶，由胶原酶II、胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶I组成；所述胶原酶II的浓度为2

【技术实现步骤摘要】
一种用于皮肤组织解离的混合酶及其制备方法、解离试剂盒、解离方法


[0001]本专利技术涉及单细胞测序
，具体涉及一种专门用于皮肤组织解离的混合酶及其制备方法；此外本专利技术还涉及一种用于皮肤组织解离的解离试剂盒及解离方法。

技术介绍

[0002]细胞是构成人体组织和器官的基本单位，在以往的研究中，大部分基因检测技术的方法是从对细胞集合性的研究，其得到的实验结果反映的是细胞群体中信号表达的平均水平，其实是针对细胞群体而产生的整体表征或者只是代表了细胞群体中在数量上占优势的细胞信息，从而忽略了单个细胞所特有的细胞异质性；然而已有大量的研究发现，在同种器官或组织中的相同类型的细胞也具有显著的异质性，并且每个细胞都具有各自独特的表达模式，细胞与细胞之间所蕴含的信息和表达水平千差万别；因此，使用细胞群体表达出的均值来进行描述的方法是不准确的，很可能会丢失或错误提示一些关键的表达信息；此外，传统的高通量测序的研究方法，难以应用在对自然界中难培养的微生物的研究、罕见循环肿瘤细胞的转录组分析、胚胎发生最早期的分化特征研究、肿瘤的非均质性和微进化研究等精确程度较高的研究领域；随着细胞分选和测序技术的进步，单细胞测序技术便应运而生并发展迅速，目前已是一大研究热点。
[0003]新一代测序技术单细胞测序技术（single
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cell sequencing，SCS）是一种在单个细胞的水平上对基因组或转录组进行高通量测序并进行分析的一项新的测序技术；单细胞测序技术与传统的高通量测序相比较而言，其不但可以快速确定成千上万个细胞的精确基因表达模式，分析出相同表型的细胞的遗传信息，还可以获得珍贵样本的重要信息，具有极其广阔的应用前景，目前已应用于肿瘤、发育生物学、神经生物学、临床诊断、免疫性疾病、宏基因组学及微生态、生殖健康、新药研发等多个领域，《Science》杂志曾将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首；单细胞测序技术大致可以分为四类：单细胞全基因组测序、单细胞转录组测序、表观遗传测序、三维基因组测序，这四种测序类型也各具优势和特点，可以从不同维度、不同层面获得处于不同阶段的细胞特征性信息；单细胞测序技术在流程上包括：单细胞悬液的制备、单细胞分离和文库制备、测序、数据分析及可视化解读。
[0004]在任何单细胞研究中，单细胞悬液的制备过程都是极其关键的，此步也是单细胞测序技术首先需要解决的问题；细胞聚集导致成团率高，或者细胞死亡率高的样本，以及一些特殊样本容易出现的细胞碎片多等的情况都会影响最终的数据质量，导致科学研究者的错误解读；因此，对于特定的目标组织有其适合的最优实验方案；将组织裂解成单细胞悬液，传统方法一般有机械分离法和酶解法，悬液制备的难点主要有：如何保证解离下来的细胞具有高活性、如何保证细胞悬液结团少、如何保证最终上机的细胞没有碎片或有极少碎片；因此，对于不同的组织类型研究者们都会先优化出最佳的解离条件，特别是对于批间差异比较大的样本，其酶解时间和酶液的配比尤为重要，需要多次优化形成，在整个单细胞测序技术中是个性化比较强的一步。
[0005]皮肤是人体最大的器官，发挥了保护、维持体温、新陈代谢、感觉、免疫、信号传递等重要功能，人体表皮细胞在皮肤组织修复、伤口愈合、皮肤老化、相关肿瘤的发生等当面发挥了重要作用，是人们进行日常活动的基本保障，随着再生医学的发展和进步，临床上和科研领域中越来越多的研究者以皮肤作为实验对象以更好的服务临床和科学研究，如人真皮结缔组织中最常见的细胞——成纤维细胞，是目前皮肤组织工程应用最为广泛的子细胞，其可以合成胶原蛋白、弹性蛋白和细胞外基质，构成皮肤组织的结构框架，并在创伤愈合过程中起到关键作用，对于成纤维细胞的研究，可以了解其功能、细胞信号传导、纤维发生、创伤修复、皮肤老化等细胞机制的重要载体。此外，随着神经内分泌学研究的进展，神经源性炎症如银屑病近年来得到不少关注，人们发现Merkel细胞与大脑中枢有着密切联系，并早已注意到Merkel细胞可能在银屑病中起到神经内分泌调节的作用， Merkel细胞位于表皮基底层，且与神经末梢紧密相连。单细胞测序技术可以在单细胞水平对基因表达情况进行分析，是研究皮肤生理功能及疾病状态的一种新的重要手段，目前单细胞RNA测序在皮肤疾病领域的研究应用刚刚起步，因此在皮肤相关领域使用单细胞测序技术的研究较少；如Joost等研究者利用单细胞测序技术研究了小鼠正常皮肤表皮的结构和组成，对小鼠毛囊间和毛囊的表皮细胞进行了测序，并根据细胞群标志性基因区分出25种不同的细胞群，另外还发现在不同空间位置的表皮干细胞有共同的基底
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表皮基因表达模式，这一研究显示出了单细胞测序技术在识别皮肤角质形成细胞亚群上的强大能力；Cheng等人利用单细胞RNA测序技术分析出人体不同部位的表皮角质形成细胞的基因特征、银屑病皮损角质形成细胞基因表达的变化，该研究揭示了正常人包皮、头皮和躯干部位的表皮，以及银屑病患者的表皮细胞基因的表达状态，为基底层角质形成细胞执行不同分化程序的能力、免疫细胞向银屑病皮损部位的募集过程等研究课题奠定了十分重要的基础；Kobayashi等研究人员对表皮、真皮及皮下组织的固有淋巴样细胞进行了单细胞RNA测序，这为研究皮肤稀有的免疫细胞提供了技术可能，他们还进一步探究了皮肤免疫细胞与皮脂腺、 共生菌群的关系，该研究为皮肤免疫细胞如何调节皮肤稳态提供了新的思路；此外，单细胞RNA测序技术也是研究肿瘤细胞异质性、肿瘤微环境组成等课题的强有力工具， 如Tirosh等人通过单细胞测序技术从黑色素瘤患者的肿瘤组织中发现恶性肿瘤细胞的聚类显示出肿瘤细胞间与细胞周期、空间环境、耐药性相关的异质性，他们还对肿瘤内的非恶性细胞进行了聚类分析，通过解析肿瘤微环境发现在肿瘤微环境中存在多种T细胞抑制性受体基因的表达，且抑制性受体基因的表达和T细胞活化的状态相关度较高，该实验表明黑素瘤中存在共刺激分子激活的T细胞衰竭机制，可以作为免疫治疗的靶点，研究结果对黑素瘤的分型和肿瘤的精准治疗具有重要的指导意义； 因此，利用单细胞测序技术，不仅可以定义皮肤组织中的细胞亚群，如角质形成细胞、成纤维细胞、树突细胞及T细胞等；还可以找到炎症性疾病及自身免疫性皮肤疾病，如银屑病、红斑狼疮、特应性皮炎等发病过程中的关键靶细胞，从而发现可能与对应疾病发展有关的免疫细胞亚群；对于皮肤肿瘤类疾病，如基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等，该技术可以助力研究者识别新的肿瘤亚型和细胞，免疫治疗提供可能的靶点线索，单细胞测序在肿瘤亚群及微环境的研究中发挥着强有力的作用；皮肤组织往往带有较多毛发且难以去除，现有的解离方法不能高效适当地处理得到大量皮肤单细胞，从而阻碍了利用单细胞测序技术对皮肤细胞进行检测和分析；目前皮肤组织常见的解离成单细胞的方法主要有胰蛋白酶消化法、中性蛋白酶＋
胶原酶消化法两种：胰蛋白酶（Trypsin）存在于很多脊椎动物的消化系统中，具有水解消化蛋白质的功能，对于组织和细胞来说，胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解，从而达到使细胞分散的作用，且不同的组织或细胞对胰蛋白酶的作用反本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于皮肤组织解离的混合酶，其特征在于，所述混合酶由胶原酶II、胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶I组成； 所述胶原酶II的浓度为2
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4mg/mL；所述胰蛋白酶的浓度为1
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3mg/mL；所述脱氧核糖核酸酶I的浓度为0.01
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0.05mg/mL。2.如权利要求1所述的一种用于皮肤组织解离的混合酶，其特征在于，所述胶原酶II的浓度为3.25mg/mL；所述胰蛋白酶的浓度为2.5mg/mL；所述脱氧核糖核酸酶I的浓度为0.02mg/mL。3.一种用于皮肤组织解离的解离试剂盒，其特征在于，所述解离试剂盒包含权利要求1或2所述的混合酶。4.如权利要求3所述的一种用于皮肤组织解离的解离试剂盒，其特征在于，所述解离试剂盒还包含缓冲液。5.如权利要求4所述的一种用于皮肤组织解离的解离试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括以下多种缓冲液：缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D和缓冲液E；所述缓冲液A为平衡盐溶液或无机盐溶液；所述缓冲液B为含10%胎牛血清的DME/F12培养基；所述缓冲液C为含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液；所述缓冲液D为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基；所述缓冲液E为1
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红细胞裂解液。6.如权利要求1或2任一项所述混合酶的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：步骤A1：将所述胶原酶II加入所述胰蛋白酶中进行溶解，得到混合母液；步骤A2：将所述脱氧核糖核酸酶I加入所述混合母液中溶解，得到混合酶。7.如权利要求6所述混合酶的制备方法，其特征在于，所述脱氧核糖核酸酶I的配置方法包含以下步骤：步骤B1：将无菌双氧水加入冻干酶中进行溶解重悬，制成工作浓度为10 mg/ml的母液；步骤B2：将缓冲液加入所述母液中进行稀释，得到所述脱氧核糖核酸酶I，所述脱氧核糖核酸酶I的工作浓度为0.01
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0.05mg/mL。8.一种使用权利要求5所述解离试剂盒的皮肤组织解离方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵莹，姚琴琴，吴小晶，周柳飞，
申请(专利权)人：上海伯豪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：