筛查结直肠癌甲基化双位点的引物探针组合及其试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种筛查结直肠癌甲基化双位点的引物探针组合和试剂盒。该引物探针组合为检测LIFR基因cg08392199位点甲基化的引物探针组合和检测SDC2基因cg25664438位点甲基化的引物探针组合；LIFR基因cg08392199位点和SDC2基因cg25664438位点的甲基化与结直肠癌存在相关性。该试剂盒包括该引物探针组合。本发明专利技术首次采用SDC2和LIFR两位点联合检测，具有创新性，在结直肠癌检测中两位点联合检测的灵敏度达到了92％，特异性高达100％，提供一个高灵敏度同时具备高特异性的结直肠癌早筛引物探针组合以及试剂盒。探针组合以及试剂盒。探针组合以及试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
筛查结直肠癌甲基化双位点的引物探针组合及其试剂盒


[0001]本专利技术属于生物技术和DNA检测
，涉及一种筛查结直肠癌甲基化双位点的引物探针组合和试剂盒。

技术介绍

[0002]结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)是常见的恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织国际癌症研究中心发布的2020年全球最新癌症数据，2020年结直肠癌在全球新发病例排名第三、死亡病例排名第二。2020年，我国新发癌症病例1929万例，其中结直肠癌新发病例数仅次于肺癌，达56万例，占比12.2％。
[0003]结直肠癌分期较为清晰，也是为数不多的可能通过筛查来预防的癌种之一。结直肠癌发病隐匿，周期较长，而且有明确的癌前阶段，从息肉发展为腺瘤通常需要10年左右。0到Ⅱ期是肠癌诊断的黄金阶段，无症状患者可以通过筛查发现癌前腺瘤，通过手术切除可以实现完全根治，早期(0/Ⅰ)结直肠癌患者的5年生存率可以达到90％以上；晚期确诊则需要通过手术治疗，效果差，复发风险高，晚期(IV期)结直肠癌患者的5年生存率不足10％。
[0004]但是我国对结直肠癌的筛查结果并不理想。根据《中国结直肠癌早诊早治专家共识(2020)》，中国各个地区和医院诊治水平参差不齐，总体诊断的早期结直肠癌患者占比约20
‑
30％，大部分患者诊断时已是中晚期。
[0005]除整体筛查意识薄弱外，缺乏有效筛查方法也是造成筛查人口渗透率低的原因之一。作为金标准的肠镜检查能力低，患者依从性低，筛查率不足。便潜血检测(FOBT)和粪便免疫化学法(FIT)等方法的灵敏度低，对进展期息肉的灵敏度仅为20～25％。
[0006]近些年，大量新技术为普及肠癌早筛提供了新的非侵入的方法。主要包括血液和粪便DNA检测。其中血液检测具有很大的局限性，早期肠道病变组织向外增生，病变细胞很难进入血液中，虽然Septin9甲基化检测在2014年版的《中国早期结直肠癌筛查及内镜诊治指南(2014)》被推荐作为筛查手段之一，但是检测灵敏度不理想。粪便检测的灵敏度和特异性都显著高于传统方法，目前看是最为理想的检测方法。
[0007]与结直肠癌发病相关的甲基化位点是粪便检测的重要依据。目前已上市的产品使用的位点包括KRAS、SDC2、SRFP2等基因，虽然总体特异性和灵敏度已经高于传统方法，但是单个位点的检测假阴性率较高，容易漏检，位点联合检出可以在保证特异度的同时，提高检测灵敏度。如CN 112553302 A专利所述SDC2位点在结直肠癌中的灵敏度为86.9％，特异性为95.9％，TFPI2位点的敏感度为90.3％，特异性为94.0％，联合检测效果未知。本专利技术提供了一个新的联合检测位点组合SDC2和LIFR，不仅各自检测效果好，而且在结直肠癌检测中两位点联合检测的灵敏度和特异性都较高。
[0008]多配体蛋白聚糖2(Syndecan
‑
2，SDC2)基因位于人类8号染色体上，编码Syndecan
‑
2蛋白。研究发现此蛋白可介导肠癌细胞的粘附等功能，与结直肠癌细胞增殖密切相关。研究证实，相对于正常结直肠组织，SDC2基因在不同分期的结直肠癌中呈现高水平的甲基化现象，提示其具有结直肠癌检测的临床价值。
[0009]白血病抑制因子受体(leukemia inhibitory factor receptor，LIFR)是近年来炎症相关因子研究的热点之一。LIFR在上世纪90年代首次报道，早期的研究主要集中在其在炎症反应中炎症因子的作用。随着人们重视炎症相关因子与肿瘤的发生发展的关系，LIFR开始重新进入人们的视线。LIFR是白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)的受体，与跨膜130kD糖蛋白(glycoprotein 130，gp130)高度同源，LIFR基因定位于人染色体5p12
‑
p13。它的功能通过与gp130形成异源二聚体，介导由白细胞介素6(interleukin
‑
6，IL
‑
6)相关因子引起的信号，包括LIF、心肌营养素1(cardiotrophin
‑
1，CT
‑
1)、抑瘤素M(oncostatin M，OSM)和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)。这些细胞因子的生物学作用差异很大，从维持干细胞多能性，保肝作用，葡萄糖的吸收，到调节细胞的增殖和分化。
[0010]粪便基质成分非常复杂，其中含有种类众多的细菌基因组DNA、植物来源DNA和动物来源DNA，肠道或其他消化道位置的脱落细胞含量相对较少，肠道脱落细胞DNA只占从粪便中回收到的总DNA的0.1％到0.01％，而人类DNA本身是高度异源的，肠道肿瘤细胞又只占肠道脱落细胞的1％，对于癌症早期的人体，还不到1％。
[0011]目前，肠道肿瘤细胞DNA的提取主要有2种方法：粪便样本总核酸提取和分子杂交捕获法。一方面，对于总核酸提取方法来说，粪便中含有多聚糖、胆盐、腐殖质、胆酸等PCR抑制物，如果从粪便中提取全部基因组，庞大的基因背景和PCR抑制物将非常不利于肿瘤脱落细胞DNA的检测；另一方面，现有分子杂交捕获技术操作繁杂，并且多数采用磁珠与探针先偶联的方法，再用该复合体去杂交捕获目的基因，该方法捕获效率低。

技术实现思路

[0012]为了解决结直肠癌筛查和诊断的关键问题——灵敏度高、特异性好，本专利技术公开了一种筛查结直肠癌甲基化双位点的引物探针组合，为检测LIFR基因甲基化cg08392199位点的引物探针组合和检测SDC2基因甲基化cg25664438位点的引物探针组合；LIFR基因cg08392199位点和SDC2基因cg25664438位点的甲基化与结直肠癌存在相关性；
[0013]所述检测LIFR基因cg08392199位点甲基化的引物探针组合包括LIFR
‑
F上游引物、LIFR
‑
R下游引物和LIFR
‑
P探针；所述LIFR
‑
F上游引物、LIFR
‑
R下游引物和LIFR
‑
P探针选自a1)
‑
a4)组合中的任意一种或多种：a1)LIFR
‑
F4、LIFR
‑
R1和LIFR
‑
P2；a2)LIFR
‑
F4、LIFR
‑
R2和LIFR
‑
P2；a3)LIFR
‑
F4、LIFR
‑
R3和LIFR
‑
P2；a4)LIFR
‑
F4、LIFR
‑
R4和LIFR
‑
P2；其中，LIFR
‑
F4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示、LIFR
‑
R1的核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.筛查结直肠癌甲基化双位点的引物探针组合，其特征在于，为检测LIFR基因甲基化cg08392199位点的引物探针组合和检测SDC2基因甲基化cg25664438位点的引物探针组合；所述检测LIFR基因甲基化cg08392199位点的引物探针组合包括LIFR
‑
F上游引物、LIFR
‑
R下游引物和LIFR
‑
P探针；所述LIFR
‑
F上游引物、LIFR
‑
R下游引物和LIFR
‑
P探针选自a1)
‑
a4)组合中的任意一种：a1)LIFR
‑
F4、LIFR
‑
R1和LIFR
‑
P2；a2)LIFR
‑
F4、LIFR
‑
R2和LIFR
‑
P2；a3)LIFR
‑
F4、LIFR
‑
R3和LIFR
‑
P2；a4)LIFR
‑
F4、LIFR
‑
R4和LIFR
‑
P2；其中，LIFR
‑
F4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示、LIFR
‑
R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示、LIFR
‑
P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示、LIFR
‑
R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示、LIFR
‑
R3的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示、LIFR
‑
R4的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述检测SDC2基因甲基化cg25664438位点的引物探针组合包括SDC2
‑
F上游引物、SDC2
‑
R下游引物和SDC2
‑
P探针；所述SDC2
‑
F上游引物、SDC2
‑
R下游引物和SDC2
‑
P探针选自b1)
‑
b4)组合中的任意一种：b1)SDC2
‑
F1、SDC2
‑
R1和SDC2
‑
P1；b2)SDC2
‑
F1、SDC2
‑
R1和SDC2
‑
P2；b3)SDC2
‑
F1、SDC2
‑
R2和SDC2
‑
P1；b4)SDC2
‑
F1、SDC2
‑
R2和SDC2
‑
P2；其中，SDC2
‑
F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、SDC2
‑
R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、SDC2

【专利技术属性】
技术研发人员：张江平，刘强，张晓勇，王彩霞，江志伟，刘梦，肖华胜，
申请(专利权)人：上海伯豪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：