本发明专利技术属于生物工程领域，涉及靶向激活HIV-1潜伏感染细胞的CRISPR/Cas9转录系统及其制备方法和在用于艾滋病基因治疗中应用。本发明专利技术中通过基于靶向HIV调控区sgRNA的dCas9-SunTag-VP64系统，提供新的、精确的放大开启基因表达的方法，使HIV潜伏感染细胞中的HIV-1前病毒得以高效、特异性激活，为后续的病毒清除奠定了基础。本发明专利技术涉及的靶向激活HIV-1潜伏感染细胞的CRISPR/Cas9转录系统可用于激活潜伏感染细胞的HIV-1前病毒，进一步用于制订艾滋病基因治疗干预措施。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，涉及CRISPR/Cas9转录系统及其制备方法和应用，具体涉及靶向激活HIV-1潜伏感染细胞的CRISPR/Cas9转录系统及其制备方法和在用于艾滋病基因治疗中应用。
技术介绍
现有技术公开了艾滋病即获得性免疫缺陷综合症，是一种由人体免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)引起的严重传染性疾病。所述病毒主要感染并破坏人体免疫系统中最重要的CD4+T淋巴细胞，导致免疫机能缺陷，抵抗力降低，最终患者由于各种机会性感染而死亡。研究实践显示，HIV于1981在临床诊断中被发现，随着人类对病毒及其感染过程的分子生物学研究以及药物研发的不断创新，艾滋病的治疗已经有了突飞猛进的发展。高效抗逆转录病毒疗法(HighActiveAntiretroviralTherapy，HAART)已经可以成功的将患者外周血病毒量控制在临床检测水平以下(小于50拷贝/mL)，显著提高了患者的生存率和生存质量(Yeni，P.G.etal.TreatmentforadultHIVinfection：2004recommendationsoftheInternationalAIDSSociety-USAPanel.JAMA.2004，292：251-65；Blankson，J.N.etal.ThechallengeofviralreservoirsinHIV-1infection.AnnuRevMed.2002，53：557-93)；人们曾寄希望于凭借HAART完全清除体内的HIV，从而达到彻底治愈AIDS的目的，但遗憾的是随后的实践证明，一旦停止药物治疗，所述病毒载量又会反弹到治疗前水平(Ho，D.D.TowardHIVeradicationorremission：thetasksahead.Science，1998.280：1866-1867.)。研究显示，HIV难以在体内被完全清除的一个重要原因是患者体内存在潜伏病毒储存库，该潜伏病毒储存库主要是由长期潜伏感染的休眠记忆CD4+T细胞和在感染初期活化的CD4+T细胞被HIV-1感染后转化为记忆T细胞构成，通常潜伏细胞在未受刺激时不表达病毒基因，因而可以逃避机体免疫系统或抗逆转录病毒药物作用(Chun，T.W.andFauci，A.S.LatentreservoirsofHIV：obstaclestotheeradicationofvirus.ProcNatlAcadSciUSA，1999.96：10958-61.)，尽管感染个体携带潜伏感染细胞数量较少，但衰减率是如此之慢，以至于欲在个体生存期内仅靠HAART治疗将其彻底清除至少目前而言是不可能的.因此，HIV潜伏感染的静息CD4+T细胞是构成机体内病毒储藏库(reservoir)的主要部分，同时也是目前临床治疗不能彻底清除HIV的巨大障碍[Finzi，D.etal.LatentinfectionofCD4+TcellsprovidesamechanismforlifelongpersistenceofHIV-1，eveninpatientsoneffectivecombinationtherapy.NatureMed.1999，5，512-517]；为了清除潜伏感染细胞，研究者提出了“激活后再清除”策略，即试图通过诱导剂来激活潜伏感染细胞中前病毒表达，另一方面，加强机体免疫系统使其识别并杀灭激活的潜伏感染细胞，同时结合HAART疗法保护细胞免受HIV感染(Richmanetal.TheChallengeofFindingaCureforHIVInfection，Science，2009，1304，323)。目前用于激活HIV-1潜伏库的药物大致可分为以下几种：(1)细胞因子和趋化因子：如肿瘤坏死因子a(TNF-a)；(2)组蛋白去乙酰化酶抑制剂：如SAHA和VPA；(3)组蛋白甲基化转移酶抑制剂：如BIX01294；(4)DNA甲基化转移酶抑制剂：主要是5-Aza以及它的衍生物；(5)蛋白激酶C激活剂：如prostratin和bryostatin-1；(6)正向转录延长因子激活剂：如HMBA和JQ1(S)；(7)其它尚未命名的物质：如disulfiram(Xing，S.andSiliciano，R.F.TargetingHIVlatency：pharmacologicstrategiestowarderadication，DrugDiscovToday，2013.18，541-51)等等；上述诱导剂分别与高效抗逆传录病毒疗法结合在临床上已取得了初步疗效，但仍存在着譬如激活效率不高或缺少靶向性及毒副作用等问题，所以本领域研究人员致力于开发更加安全有效的激活药物或找到可以协同使用的药物。有研究公开了人工设计的转录效应因子系统在靶向调控基因表达和生物功能方面显示出一定的优势，该系统包含特异性结合基因组序列的DNA结合结构域和转录效应结构域两部分：锌指蛋白(zincfingerproteins，ZFPs)和转录激活子样效应因子(transcriptionactivator-likeeffectors，TALEs)介导细胞中基因转录调控为最先代表。复旦大学朱焕章教授课题组首次利用锌指蛋白(WangPetal.SpecificreactivationoflatentHIV-1withdesignerzinc-fingertranscriptionfactorstargetingtheHIV-15′-LTRpromoter.Genetherapy.2014，21：490-495)和转录激活子样效应因子(WangXetal.DesignedTALEproteinsefficientlyinducedtheexpressionoflatentHIV-1inlatentlyinfectedcells.AidsResHumRetrov.2015，31：98-106)介导的转录激活系统实现对HIV-1潜伏感染细胞模型的有效和特异激活研究，激活效率为30％左右；但是ZFPs和TALEs使用的同时存在有很多的限制：例如基因组特定序列的限制、需要大规模筛选、模块的步步组装等繁琐过程，因此，在调控基因表达方面尚不能被广泛应用。最近基于成簇的规律间隔的短回文重复序列CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat)新一代基因编辑工具CRISPR/Cas9的出现带来了很多的优越性，由于该系统中简便设计的sgRNA，因此在基因治疗领域中备受关注；在后续的研究报道中显示将内切酶失活的dCas9(deadCas9)与转录激活结构域结合，可以实现对靶标基因的表达上调；最初的研究中显示dCas9与一个拷贝的激活结构域(VP64)结合(dCas9-VP64)介导对目的基因的激活效率不是很理想，在一定程度上限制了应用；为了解决效率低这一问题，后续的研究中显示利用多个非重叠(non-overlapping)的sgRNAs结合使用介导dCas9-VP64对特定基因表达进行调控，虽然，提高了激活效率，可是本文档来自技高网...
【技术保护点】
干预HIV‑1潜伏的CRISPR/Cas9转录系统，其特征在于，通过基于靶向HIV调控区sgRNA的dCas9‑SunTag‑VP64转录系统，放大开启基因表达，高效、特异性激活HIV潜伏感染细胞中的HIV‑1前病毒。
【技术特征摘要】
1.干预HIV-1潜伏的CRISPR/Cas9转录系统，其特征在于，通过基于靶向HIV调控区sgRNA的dCas9-SunTag-VP64转录系统，放大开启基因表达，高效、特异性激活HIV潜伏感染细胞中的HIV-1前病毒。2.按权利要求1所述的干预HIV-1潜伏的CRISPR/Cas9转录系统，其特征在于，所述的dCas9-SunTag-VP64转录系统由如下成分构成：(1)pHR重组载体：dCas9-24×GCN4-V4；(2)pHR重组载体：scFv-GCN-sfGFP-VP64；(3)pZDonor重组载体：sgRNA。3.按权利要求1所述的干预HIV-1潜伏的CRISPR/Cas9转录系统，其特征在于，所述的sgRNA重组载体来源于pZDonor。4.按权利要求1所述的干预HIV-1潜伏的CRISPR/Cas...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱焕章，季海燕，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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