本发明专利技术涉及分子生物学和分子病毒学领域的病毒检测技术，特别涉及一种快速鉴别新城疫强毒株的逆转录荧光定量PCR引物及使用PCR引物快速鉴别新城疫强毒株的方法，提取待鉴别毒株RNA，进行RT-qPCR扩增，当病毒核酸成功扩增时，则待鉴别病毒为NDV强毒株；当病毒核酸不能扩增时，则待鉴别病毒不是NDV强毒株。本发明专利技术的鉴别方法只需要进行一次RT-qPCR扩增，就能判断待检病毒是否是NDV强毒株，检测方法简便、灵活易操作；检测出的RNA最低浓度为1拷贝/μL，检测灵敏度高；设计的引物只能扩增NDV强毒株，而对弱毒株和其他毒株都没有扩增，特异性强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和分子病毒学领域的病毒检测技术，特别涉及一种快速鉴别新城疫强毒株的逆转录荧光定量PCR引物，还涉及使用所述引物的鉴别方法。
技术介绍
新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus)引起的一种急性、高度接触性禽类传染病，是世界动物卫生组织(OIE)规定的法定报告疫病，给许多国家的养禽业造成巨大的经济损失。NDV又称禽副黏病毒I型，在分类上属于单链负股病毒目、副黏病毒科、副黏病毒亚科的禽腮腺炎病毒属。NDV基因组包含6个开放阅读框，从5 ’到3 ’依次编码L-HN-F-M-P-NP 6种结构蛋白，其中F蛋白是最主要的糖蛋白之一，病毒毒力的强弱与其裂解位点区的氨基酸序列相关，强毒株氨基酸序列一般为mR/K-R-Q_K/R-R-Fm，而弱毒株则改变为mG/E-K/R-Q-G/E-R-Lm，氨基酸序列的变化导致了NDV FO蛋白不易被裂解，从而降低了病毒囊膜与宿主细胞膜的融合活性，使病毒感染性降低或者无感染性，这也是在基因水平上区分NDV强、弱毒株的把点，因此，可以以此进行NDV强弱毒株的区分。目前，我国对于新城疫的防控依赖于疫苗，有效的疫苗和合理的免疫程序很大程度上控制了该病的爆发和流行。但由于我国养殖环境复杂，标准化、规模化养殖水平不足，致使新城疫疫情时有发生，并常以非典型病症呈现，所以必须经实验室诊断进行病例的确诊和病毒的分离、鉴定。NDV检测主要使用PCR技术和血清学技术，而分离鉴定则主要采用鸡胚接种传代方法。然而，由于疫苗(灭活疫苗和弱毒苗)的广泛使用和一些天然弱毒株的存在，从免疫鸡群中检测到的NDV可能是被接种的疫苗病毒或者是不至于引起发病的弱毒株，所以即使检测和分离到了NDV，也不能确定鸡群感染了野毒，发生了新城疫疫情。所以，准确掌握NDV的感染情况，首先要排除疫苗毒的干扰。建立快速、准确区分NDV强、弱毒株的方法，可以第一时间确定是否发生了新城疫疫情，以便有效控制危害性大的NDV强毒对鸡群的感染。黄淑坚等(养禽与禽病防治，2009，4:18-21)设计了两对特异性引物建立了区分NDV强、弱毒的PCR方法(检测敏感性为10pg，换算成拷贝数大概为15拷贝)；岳华等(中国兽医学报，2007，27(3): 300-304)建立了基于TaqMan探针的检测中、强毒力新城疫病毒RNA的荧光定量方法(TaqMan探针造价高，检测敏感性为60拷贝)，但前者在操作的简便性和灵敏度方面有所欠缺，后者则在检测成本和灵敏度方面有提升空间。公开号为CN101153343A的中国专利技术专利申请，公开了一种特异检测强毒型和中毒型鸡新城疫病毒的荧光定量PCR引物及方法，来鉴别强毒型和中毒型鸡新城疫病毒，但灵敏度方面依然不够理想。
技术实现思路
为了解决以上鉴别强弱毒鸡新城疫病毒技术中存在的成本高、敏感性差的问题，本专利技术提供了一种快速、灵敏、低成本的区分NDV强弱毒株的方法。本专利技术基于NDV强、弱毒基因序列的分析，通过特异性引物的设计，建立标准曲线，最终构建了基于SYBR Green I嵌合荧光的鉴别NDV强毒的逆转录焚光定量PCR(reverse transcript1n fluorescencequantitative PCR，RT_qPCR)方法。本专利技术是通过以下步骤得到的: 本专利技术所述的特异性引物的设计，是根据GenBank中登录的所有NDV F基因序列，筛选与强弱毒裂解位点关联一致的序列，然后根据强毒的序列特征设计一对特异性引物，从而达到只扩增强毒而不扩增弱毒的目的。引物序列如下:NDV F realtime-1:5’- AGGACGGAGACARAARCGCT -3’NDV F realtime-2: 5’- AGTCGGAGGATGTTGGCAGC -3’ 扩增产物长度为131bp。另设计合成了含T7启动子的上游序列NDV F realtime-T7-l:5’- TAATACGACTCACTATAGGG AGGACGGAGACARAARCGCT _3’，用于体外转录模板的制备。本专利技术所述的鉴别NDV强毒的RT-qPCR方法的建立，首先需要进行强毒NDV RNA的提取和体外转录模板的制备。经TRizol法提取强毒株NDV的RNA，以提取的RNA为模板，以NDV F realtime-T7-l、NDV F realtime-2为引物经一步法RT-PCR扩增得到的目的条带作为体外转录模板。优选的一步法RT-PCR反应体系为:PrimeScript I step enzyme mix 2yL，2*l step buffer 25yL，NDV F realtime-T7_l引物lOOpmol/yL lyL，NDV F realtime-2引物10pmolAiL IyL，RNA模板2yL，RNase free水补足50yL。优选的一步法RT-PCR反应条件为:50°C 反转录30 min; 95°C 预变性2 min; 94°C变性I min, 53°C退火30 s, 72°C延伸I min,共32个循环；72°C延伸10 min。其次进行RNA标准品的合成，取IyL体外转录模板进行T7RNA聚合酶进行体外转录，按体外转录试剂盒说明书(T7 RNA Polymerase, TaKaRa)进行操作，产物最终溶解于DEPC水中，并用紫外分光光度计测其浓度。通过公式将得到的RNA换算为拷贝数，并用RNase Free Water进行10倍倍比稀释，将稀释的RNA作为标准品，-80°C保存。对RT-qPCR的引物浓度、退火温度等条件经行摸索，以得到最佳的反应条件，反应体系为 20yL，其中 2 XOne Step SYBR RT-PCR Buffer 10yL；Ex Taq HS 0.4 yL；Primescript rt enzyme mix Π 0.4 yL; NDV F realtime-1、NDV F realtime-2弓丨物(10μΜ)各 lyL;Rnase Free dH20 5.2 yL;Total RNA 2 yL。反应条件确定为:42°C 反转录 5min; 95 °C 预变性3 min; 94 °C 10 s, 53°C 10s, 72°C 20 s，进行40 个循环的扩增，每个循环收集荧光信号。最后根据反应条件的优化，确定反应的检测方法的标准曲线。选择108、17、106、15、14、13拷贝/yL 6个浓度梯度的RNA标准品作为模板进行RT-qPCR扩增，每个浓度的标准品做3个重复，从而得到各自的动力学曲线，进而获得标准曲线，并最终完成鉴别和定量检测NDV强、弱毒的RT-qPCR方法的建立。—种使用上述的PCR引物快速鉴别新城疫强毒株的方法，提取待鉴别毒株RNA，以此为模板，进行RT-qPCR扩增，当病毒核酸成功扩增时，则待鉴别病毒为NDV强毒株；当病毒核酸不能扩增时，则待鉴别病毒不是NDV强毒株。有益效果: 本专利技术的鉴别方法只需要进行一次RT-qPCR扩增，就能判断待检病毒是否是NDV强毒株，检测方法简便、灵活易操作;检测出的RNA最低浓度为I拷贝AxL，检测灵敏度高;设计本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速鉴别新城疫强毒株的逆转录荧光定量PCR引物，其特征在于碱基序列如下：NDV F realtime‑1:5’‑ AGGACGGAGACARAARCGCT ‑3’，NDV F realtime‑2: 5’‑ AGTCGGAGGATGTTGGCAGC ‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张琳，胡北侠，刘伟杰，张秀美，杨少华，黄艳艳，许传田，黄庆华，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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