用于调节RNA的组合物和方法技术

本发明专利技术的一些方面涉及用于以靶向方式提高基因表达的方法。在一些实施方案中，提供了可用于以靶向方式转录后改变蛋白质和/或RNA水平的方法和组合物。本文中公开的本发明专利技术的一些方面提供了可用于保护RNA免受降解(例如，核酸外切酶介导的降解)的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉应用本申请依据35U.S.C.§119(e)要求于2014年6月10日提交的标题为“COMPOSITIONSANDMETHODSFORMODULATINGRNASTABILITY”的美国临时申请No.62/010,417、于2013年10月31日提交的标题为“COMPOSITIONSANDMETHODSFORMODULATINGRNASTABILITY”的美国临时申请No.61/898,461和于2013年8月16日提交的标题为“COMPOSITIONSANDMETHODSFORMODULATINGRNASTABILITY”的美国临时申请No.61/866,989的权益，其内容分别通过引用整体并入本文。
本专利技术涉及基于寡核苷酸的组合物，以及使用基于寡核苷酸的组合物来调节核酸的方法。
技术介绍
相当一部分的人疾病可通过选择性地改变疾病相关转录单位(非编码RNA、编码蛋白质的RNA或者其他调节性编码或非编码基因组区)的蛋白质和/或RNA水平来治疗。用于抑制基因表达的方法是本领域中已知的，并且包括例如反义、RNAi和miRNA介导的方法。这样的方法可涉及阻断mRNA的翻译或引起靶RNA的降解。然而，可用于提高基因表达的方法有限。
技术实现思路
本文中公开的本专利技术的一些方面涉及可用于调节核酸的方法和组合物。在一些实施方案中，本文中提供的方法和组合物可用于保护RNA(例如，RNA转录物)免受降解(例如，核酸外切酶介导的降解)。在一些实施方案中，所保护的RNA存在于细胞外。在一些实施方案中，所保护的RNA存在于细胞中。在一些实施方案中，提供了可用于以靶向方式转录后改变蛋白质和/或RNA水平的方法和组合物。在一些实施方案中，本文中公开的方法涉及降低或防止所靶向RNA的降解或加工，从而升高所靶向RNA的稳态水平(steadystatelevel)。在一些实施方案中，本文中公开的方法还可或可替选地涉及提高所靶向RNA的翻译或提高所靶向RNA的转录，从而以靶向方式升高RNA水平和/或蛋白质水平。本专利技术的一些方面涉及这样的认识：某些RNA降解是由核酸外切酶介导的。在一些实施方案中，核酸外切酶可从RNA3’端和/或5’端破坏RNA。期望不受理论的限制，在一些实施方案中，认为可通过使RNA与跟RNA在或接近一端或两端杂交的寡核苷酸(oligo)接触来保护RNA的一端或两端免受核酸外切酶酶活性，从而提高RNA的稳定性和/或水平。如本文中公开的，通过在或接近一端或两端靶向RNA来提高RNA稳定性和/或水平的能力是令人惊讶的，部分地是因为存在(例如，细胞中)能够通过内侧切割来破坏RNA的核酸外切酶。另外，在一些实施方案中，令人惊讶的是，5’靶向寡核苷酸单独(例如，不与3’靶向寡核苷酸组合，或者在假环化寡核苷酸的情形下)有效地稳定RNA或提高RNA水平，因为在细胞中例如3’端加工核酸外切酶可占优势(例如，与5’端加工核酸外切酶相比)。然而，在一些实施方案中，将3’靶向寡核苷酸与5’靶向寡核苷酸组合使用或者单独使用以稳定靶RNA。在一些实施方案中，当所靶向的RNA是编码蛋白质的RNA时，则该RNA的稳态水平提高导致所编码蛋白质的水平伴随地提高。因此，在一些实施方案中，本文中提供了当递送至细胞时提高靶RNA的蛋白质水平的寡核苷酸(包括5’靶向、3’靶向和假环化寡核苷酸)。在一些实施方案中，值得注意的是，不仅靶RNA水平提高，而且所得翻译产物也得以增加。在一些实施方案中，这一结果是令人惊讶的，部分地是因为以下了解：对于发生翻译而言，核糖体机器要求接近RNA的某些区域(例如，5’帽区、起始密码子等)以有利于翻译。在一些实施方案中，当所靶向的RNA是非编码的RNA时，则非编码RNA的稳态水平提高导致与该非编码RNA相关的活性伴随地提高。例如，在非编码RNA是miRNA的情况下，miRNA的稳态水平提高可导致由该miRNA靶向的mRNA降解增加。在一些实施方案中，提供了具有适于在细胞内递送、杂交和稳定以靶向并使RNA转录物稳定的化学性质的寡核苷酸。另外，在一些实施方案中，提供了可用于控制寡核苷酸的药代动力学、生物分布、生物利用度和/或效力的寡核苷酸化学物质。在本专利技术的一些方面，提供了用于使合成RNA(例如，待递送至细胞的合成RNA)稳定的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及使合成RNA与一种或更多种寡核苷酸接触，所述寡核苷酸与合成RNA的5’区和合成RNA的3’区结合并且当与合成RNA结合时与所述合成RNA形成环化(circularized)产物。在一些实施方案中，使合成RNA与一种或更多种寡核苷酸在细胞外接触。在一些实施方案中，所述方法还涉及将环化产物递送至细胞。在本专利技术的一些方面，提供了用于在细胞中提高蛋白质的表达的方法，其涉及向细胞递送编码所述蛋白质的环化的合成RNA，其中在向所述细胞递送环化的RNA之后，所述蛋白质在所述细胞中的合成增加。在一些实施方案中，所述环化的合成RNA包含一个或更多个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，提供了这样的方法，其涉及向细胞递送编码蛋白质的环化的合成RNA，其中在向所述细胞递送所述环化的合成RNA之后，所述蛋白质在所述细胞中的合成增加。在一些实施方案中，环化的合成RNA是单链的共价闭合环状RNA。在一些实施方案中，单链的共价闭合环状RNA包含一个或更多个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，环化的合成RNA通过合成具有5’和3’端的RNA并将5’和3’端连接在一起形成。在一些实施方案中，环化的合成RNA如下形成：产生合成RNA(例如，通过体外转录或人工(非天然)化学合成)并使所述合成RNA与一种或更多种寡核苷酸接触，所述寡核苷酸与所述合成RNA的5’区和所述合成RNA的3’区结合并且当与所述合成RNA结合时与所述合成RNA形成环化产物。在一些实施方案中，提供了用于使合成RNA稳定的方法，其涉及在第一稳定化寡核苷酸和第二稳定化寡核苷酸与合成RNA上的靶序列杂交的条件下使所述合成RNA与所述第一稳定化寡核苷酸和所述第二稳定化寡核苷酸接触，所述第一稳定化寡核苷酸靶向所述合成RNA的5’区，所述第二稳定化寡核苷酸靶向所述合成RNA的3’区。在一些实施方案中，第一稳定化寡核苷酸与第二稳定化寡核苷酸共价连接以使得合成RNA在与所述第一和第二稳定化寡核苷酸杂交时形成环化产物。在一些实施方案中，使合成RNA与第一和第二稳定化寡核苷酸在细胞外接触。在一些实施方案中，提供了向细胞递送合成RNA的方法，其涉及：在第一稳定化寡核苷酸和第本文档来自技高网...

【技术保护点】
在细胞中提高基因表达的方法，所述方法包括：向细胞递送包含通式5’‑X1‑X2‑3’的寡核苷酸，其中X1包含具有互补区的5至20个核苷酸，所述互补区与由所述基因编码的RNA转录物的至少5个连续核苷酸互补，其中X1之所述互补区3’端的核苷酸与所述RNA转录物的转录起始位点的核苷酸互补；并且X2包含1至20个核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.16 US 61/866,989;2013.10.31 US 61/898,461;1.在细胞中提高基因表达的方法，所述方法包括：
向细胞递送包含通式5’-X1-X2-3’的寡核苷酸，其中X1包含具有互补区的5至20个核苷
酸，所述互补区与由所述基因编码的RNA转录物的至少5个连续核苷酸互补，其中X1之所述
互补区3’端的核苷酸与所述RNA转录物的转录起始位点的核苷酸互补；并且X2包含1至20个
核苷酸。
2.权利要求1所述的方法，其中所述RNA转录物在其5’端具有7-甲基鸟苷帽。
3.权利要求1所述的方法，其中所述RNA转录物具有7-甲基鸟苷帽，并且其中X1之所述互
补区3’端的核苷酸与紧接所述7-甲基鸟苷帽内侧的RNA转录物的核苷酸互补。
4.权利要求1所述的方法，其中X25’端的至少第一核苷酸是与鸟嘌呤互补的嘧啶。
5.权利要求2所述的方法，其中X25’端的第二核苷酸是与鸟嘌呤互补的嘧啶。
6.权利要求1所述的方法，其中X2包含式5’-Y1-Y2-Y3-3’，其中X2形成具有环区和茎区的
茎环结构，所述环区包含Y2的核苷酸，所述茎区包含与Y3的至少两个连续核苷酸杂交的Y1的
至少两个连续核苷酸。
7.权利要求6所述的方法，其中Y1、Y2和Y3独立地包含1至10个核苷酸。
8.权利要求6或7所述的方法，其中Y3在紧接所述茎区3’端之后的位置包含与鸟嘌呤互
补的嘧啶。
9.权利要求2至8中任一项所述的方法，其中所述与鸟嘌呤互补的嘧啶是胞嘧啶。
10.权利要求1所述的方法，其中X2包含与所述RNA转录物的至少5个连续核苷酸互补的
互补区，所述至少5个连续核苷酸不重叠于与X1的所述互补区互补的RNA转录物区。
11.权利要求10所述的方法，其中X2的所述互补区在所述RNA转录物之多腺苷酸化接点
的100个核苷酸之内。
12.权利要求11所述的方法，其中X2的所述互补区在紧邻或重叠于所述RNA转录物之所
述多腺苷酸化接点的位置处与该RNA转录物互补。
13.权利要求11或12所述的方法，其中X2还包含至少2个连续的嘧啶核苷酸，所述嘧啶核
苷酸与所述RNA转录物的poly(A)尾的腺嘌呤核苷酸互补。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是mRNA、非编码RNA、长非
编码RNA、miRNA、或snoRNA、或任何其他合适的RNA。
15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是mRNA转录物，并且其中
X2包含与所述转录物之3’-UTR中的至少5个连续核苷酸互补的互补区。
16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是mRNA，并且所述递送导
致由所述mRNA编码的蛋白质水平的提高。
17.权利要求16所述的方法，其中与未递送该寡核苷酸的合适对照细胞相比，由所述
mRNA编码之蛋白质水平的提高至少提高50％。
18.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是由选自以下的基因表
达的mRNA：ABCA1、APOA1、ATP2A2、BDNF、FXN、HBA2、HBB、HBD、HBE1、HBG1、HBG2、SMN、UTRN、
PTEN、MECP2和FOXP3。
19.权利要求1所述的方法，其中X1包含序列5’-CGCCCTCCAG-3’。
20.权利要求19所述的方法，其中X2包含序列CC。
21.权利要求20所述的方法，其中X2包含序列5’-CCAAAGGTC-3’。
22.权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸包含序列5’-CGCCCTCCAGCCAAAGGTC-3’。
23.权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是由选自以下的基因表
达的mRNA：ABCA4、ABCB11、ABCB4、ABCG5、ABCG8、ADIPOQ、ALB、APOE、BCL2L11、BRCA1、CD274、
CEP290、CFTR、EPO、F7、F8、FLI1、FMR1、FNDC5、GCH1、GCK、GLP1R、GRN、HAMP、HPRT1、IDO1、
IGF1、IL10、IL6、KCNMA1、KCNMB1、KCNMB2、KCNMB3、KCNMB4、KLF1、KLF4、LDLR、MSX2、MYBPC3、
NANOG、NF1、NKX2-1、NKX2-1-AS1、PAH、PTGS2、RB1、RPS14、RPS19、SCARB1、SERPINF1、SIRT1、
SIRT6、SMAD7、ST7、STAT3、TSIX和XIST。
24.在细胞中提高基因表达的方法，所述方法包括向细胞递送具有第一区和第二区的
长度为10至50个核苷酸的寡核苷酸，所述第一区与由所述基因编码之mRNA转录物的5’-UTR
的至少5个连续核苷酸互补，所述第二区与所述mRNA转录物之3’-UTR的至少5个连续核苷
酸、所述mRNA转录物之poly(A)尾的至少5个连续核苷酸或重叠于所述mRNA转录物之多腺苷
酸化接点的至少5个连续核苷酸互补。
25.权利要求24所述的方法，其中所述5’-UTR的所述至少5个连续核苷酸中的第一个在
所述mRNA转录物之5’-甲基鸟苷帽的10个核苷酸之内。
26.权利要求24或25所述的方法，其中所述第二区与重叠于所述多腺苷酸化接点的至
少5个连续核苷酸互补。
27.权利要求24至26中任一项所述的方法，其还包含将所述第一区的5’端与所述第二
区的3’端连接的2至20个核苷酸。
28.权利要求24至26中任一项所述的方法，其还包含将所述第一区的3’端与所述第二
区的5’端连接的2至20个核苷酸。
29.权利要求24至28中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度为10至50个核苷
酸。
30.权利要求24至28中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度为9至20个核苷
酸。
31.在细胞中提高基因表达的方法，所述方法包括向细胞递送包含通式5’-X1-X2-3’的
寡核苷酸，其中X1包含2至20个与腺嘌呤形成碱基对的嘧啶核苷酸；并且X2包含与由所述基
因编码之多腺苷酸化RNA转录物的至少3个连续核苷酸互补的互补区，其中X2之所述互补区
5’端的核苷酸与所述RNA转录物中紧接所述RNA转录物之多腺苷酸化接点内侧的核苷酸互
补。
32.权利要求31所述的方法，其中X1包含2至20个胸苷或尿苷。
33.权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核
苷间键。
34.权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核
苷酸。
35.权利要求1至34中任一项所述的方法，其中至少一个核苷酸包含2’O-甲基。
36.权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含至少一个核糖核苷
酸、至少一个脱氧核糖核苷酸、至少一个2’-氟-脱氧核糖核苷酸或至少一个桥连核苷酸。
37.权利要求36所述的方法，其中所述桥连核苷酸是LNA核苷酸、cEt核苷酸或ENA修饰
的核苷酸。
38.权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸的每个核苷酸均为LNA核
苷酸。
39.权利要求1至38中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的核苷酸包含交替的
脱氧核糖核苷酸和2’-氟-脱氧核糖核苷酸、2’-O-甲基核苷酸或桥连核苷酸。
40.权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸是混合体。
41.权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸是吗啉代寡核苷酸。
42.权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述细胞在体外。
43.权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述细胞在体内。
44.在细胞中提高基因表达的方法，所述方法包括向表达所述基因之RNA转录物的细胞
递送长度为8至50个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与RNA转录物的至少5个连续核
苷酸互补的互补区，其中所述互补区3’端的核苷酸与在所述RNA转录物之转录起始位点的
10个核苷酸之内的核苷酸互补，其中所述寡核苷酸包含通过至少一个经修饰的核苷间键连
接的核苷酸或至少一个桥连核苷酸。
45.在细胞中提高基因表达的方法，所述方法包括向表达所述基因之RNA转录物的细胞
递送包含两个互补区的寡核苷酸，所述互补区各自与RNA转录物的至少5个连续核苷酸互
补，其中第一互补区3’端的核苷酸与在所述RNA转录物之转录起始位点的100个核苷酸之内
的核苷酸互补，并且其中第二互补区与末端在所述RNA转录物3’端的300个核苷酸之内的
RNA转录物区互补。
46.在细胞中提高RNA转录物之稳定性的方法，所述方法包括向所述细胞递送第一稳定
化寡核苷酸和第二稳定化寡核苷酸，所述第一稳定化寡核苷酸靶向所述RNA转录物的5’区，
所述第二稳定化寡核苷酸靶向所述RNA转录物的3’区。
47.权利要求46所述的方法，其中所述第一稳定化寡核苷酸与所述第二稳定化寡核苷
酸共价连接。
48.权利要求46或47所述的方法，其中所述第一稳定化寡核苷酸包含互补区，所述互补
区在所述RNA转录物5’端之第一个被转录核苷酸的10个核苷酸之内的位置处与该RNA转录
物互补。
49.权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物包含5’-甲基鸟苷帽，并
且其中所述第一稳定化寡核苷酸包含互补区，所述互补区在紧接所述5’-甲基鸟苷帽内侧
之核苷酸的10个核苷酸之内的位置处与该RNA转录物互补。
50.权利要求46至49中任一项所述的方法，其中所述第二稳定化寡核苷酸包含互补区，
所述互补区在所述RNA转录物3’端的250个核苷酸之内的位置处与该RNA转录物互补。
51.权利要求46至50中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物包含3’-poly(A)尾，并
且其中所述第二稳定化寡核苷酸包含互补区，所述互补区在所述RNA转录物之多腺苷酸化
接点的100个核苷酸之内的位置处与该RNA转录物互补。
52.权利要求46至51中任一项所述的方法，其中所述第二稳定化寡核苷酸的所述互补
区与所述RNA转录物的多腺苷酸化接点紧邻或重叠。
53.在细胞中提高RNA转录物之稳定性的方法，所述方法包括向表达所述RNA转录物的
细胞递送靶向所述RNA转录物之权利要求64至104中任一项所述的寡核苷酸，从而提高所述
RNA转录物的稳定性。
54.权利要求46至53中任一项所述的方法，其中所述细胞在体外。
55.权利要求46至53中任一项所述的方法，其中所述细胞在体内。
56.在对象中治疗与RNA转录物水平降低相关的病症或疾病的方法，所述方法包括向所
述对象施用权利要求64至104中任一项所述的寡核苷酸。
57.权利要求46至56中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是mRNA、非编码RNA、长
非编码RNA、miRNA、snoRNA、tRNA、snRNA、胞外RNA或任何其他合适的RNA。
58.权利要求46至56中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是mRNA。
59.权利要求46至56中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是长非编码RNA。
60.权利要求46至58中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是由选自以下的基因表
达的mRNA：ABCA1、APOA1、ATP2A2、BDNF、FXN、HBA2、HBB、HBD、HBE1、HBG1、HBG2、SMN、UTRN、
PTEN、MECP2和FOXP3。
61.权利要求46至58中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是由选自以下的基因表
达的mRNA：ABCA4、ABCB11、ABCB4、ABCG5、ABCG8、ADIPOQ、ALB、APOE、BCL2L11、BRCA1、CD274、
CEP290、CFTR、EPO、F7、F8、FLI1、FMR1、FNDC5、GCH1、GCK、GLP1R、GRN、HAMP、HPRT1、IDO1、
IGF1、IL10、IL6、KCNMA1、KCNMB1、KCNMB2、KCNMB3、KCNMB4、KLF1、KLF4、LDLR、MSX2、MYBPC3、
NANOG、NF1、NKX2-1、NKX2-1-AS1、PAH、PTGS2、RB1、RPS14、RPS19、SCARB1、SERPINF1、SIRT1、
SIRT6、SMAD7、ST7、STAT3、TSIX和XIST。
62.长度为8至50个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与RNA转录物的至少5个连续
核苷酸互补的互补区，其中所述互补区3’端的核苷酸与在所述RNA转录物之转录起始位点
的10个核苷酸之内的核苷酸互补，其中所述寡核苷酸包含通过至少一个经修饰的核苷间键
连接的核苷酸或至少一个桥连核苷酸。
63.包含两个互补区的寡核苷酸，所述互补区各自与RNA转录物的至少5个连续核苷酸
互补，其中第一互补区3’端的核苷酸与在所述RNA转录物之转录起始位点的100个核苷酸之
内的核苷酸互补，并且其中第二互补区与末端在所述RNA转录物3’端的300个核苷酸之内的
RNA转录物区互补。
64.包含通式5’-X1-X2-3’的寡核苷酸，其中
X1包含具有互补区的5至20个核苷酸，所述互补区与RNA转录物的至少5个连续核苷酸互
补，其中X1之所述互补区3’端的核苷酸与所述RNA转录物的转录起始位点的核苷酸互补；并
且X2包含1至20个核苷酸。
65.权利要求62至64中任一项所述的寡核苷酸，其中所述RNA转录物在其5’端具有7-甲
基鸟苷帽。
66.权利要求64所述的寡核苷酸，其中所述RNA转录物具有7-甲基鸟苷帽，并且其中X1之
所述互补区3’端的核苷酸与紧接所述7-甲基鸟苷帽内侧的RNA转录物的核苷酸互补。
67.权利要求64所述的寡核苷酸，其中X25’端的至少第一核苷酸是与鸟嘌呤互补的嘧
啶。
68.权利要求67所述的寡核苷酸，其中X25’端的第二核苷酸是与鸟嘌呤互补的嘧啶。
69.权利要求64所述的寡核苷酸，其中X2包含式5’-Y...

【专利技术属性】
技术研发人员：法提赫·厄兹索拉克，卡罗琳·伍，
申请(专利权)人：RANA医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US