表达载体制造技术

本发明专利技术提供了用于蛋白的细胞表面表达的表达载体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表达载体自从Kohler和Milstein于1975年发现单克隆抗体(mAbs)以来,它们已成为极有价值的分子工具。由于它们的高特异性，单克隆抗体(mAbs)被用于生物学范畴中的标准技术，成为对蛋白功能和分布进行表征的关键。除了它们在基础研究中的应用之外，mAbs还被广泛用作为诊断和治疗活性剂。由于它们的广泛应用范围，mAbs的产生成为标准流程。但是，其仍可能存在问题，因为对于生理学设置中的研究而言，mAbs识别以其天然构象存在的抗原是很重要的。最常见地，针对源于靶蛋白的预测序列的合成肽来制造mAbs。不幸的是，这些Abs虽然具有与肽的强烈反应性，但频繁失败于识别天然蛋白。产生mAbs的另一标准流程使用重组表达的蛋白。原核表达系统是最广泛使用的表达宿主。但是当研究哺乳动物表面蛋白时，通常必须要使用哺乳动物表达系统，因为它们更可能产生具有合适的二硫键、翻译后糖基化或蛋白水解修饰的功能性蛋白。对重组蛋白的纯化通常是繁琐的任务，这经常代表着获得抗体的限制性步骤。虽然引入亲和标签能简化纯化，但以足够的产率及纯度获得天然构象的重组蛋白仍是困难的。这最显著地应用于膜相关蛋白，因为它们可能在纯化过程期间丢失其天然结构。当企图产生能识别处于天然背景的蛋白的mAbs时，下述也很关键不仅在免疫步骤中、还要在筛选流程中也使用天然构象的蛋白。很多标准杂交瘤筛选方案(例如将重组蛋白固定于固体支持物上)可显著改变蛋白构象。就这些原因而言，基于与重组蛋白的结合选择的mAbs可能不能结合处于天然背景的相同蛋白。因此，需要允许在细胞的细胞表面表达天然构象的抗原的抗原表达系统。在第一个目的中，本专利技术提供了用于蛋白的细胞表面表达的核酸表达载体，所述载体依序包含编码分泌信号肽的多核苷酸序列、用于插入编码待表达蛋白的多核苷酸序列的克隆位点、和编码血型糖蛋白的跨膜结构域的多核苷酸序列。在核酸表达载体的一种优选实施方式中，血型糖蛋白的跨膜结构域是血型糖蛋白A的跨膜结构域。在核酸表达载体的另一优选实施方式中，血型糖蛋白A的跨膜结构域是小鼠血型糖蛋白A跨膜结构域或亚美尼亚仓鼠(Armenian hamster)血型糖蛋白A结构域。在核酸表达载体的另一优选实施方式中，小鼠血型糖蛋白A跨膜结构域包含Seq.Id. No. I中公开的氨基酸序列，亚美尼亚仓鼠血型糖蛋白A结构域包含Seq. Id. No. 12中公开的氨基酸序列。在核酸表达载体的另一优选实施方式中，分泌信号肽是蜂毒肽(bee-venommeIittin)的分泌信号肽。在核酸表达载体的另一优选实施方式中，蜂毒肽的分泌信号肽包含Seq. Id. No. 2中公开的氨基酸序列。在另一优选的实施方式中，核酸表达载体还在用于插入编码待表达蛋白的多核苷酸序列的克隆位点下游(3’ )包含编码FLAG标签的多核苷酸序列，所述标签包含Seq.Id. No. 3的氨基酸序列。在另一优选的实施方式中，核酸表达载体还在编码血型糖蛋白的跨膜结构域的多核苷酸序列下游(3’)包含编码His标签(优选地，包含Seq.Id. No. 4中公开的氨基酸序列的His标签)的多核苷酸序列。在核酸表达载体的另一优选实施方式中，克隆位点包含NheI、KpnI、BamHI、EcoRI、EcoRV和NotI的限制性酶切割位点。在另一优选的实施方式中，核酸表达载体包含选自由Seq. Id. No. 5、Seq.Id. No. 13、Seq. Id. No. 14和Seq. Id. No. 15构成的组的多核苷酸序列。在核酸表达载体的另一优选实施方式中，待表达的蛋白是膜相关蛋白。在第二个目的中，本专利技术提供了包含本专利技术的载体的细胞，优选地，哺乳动物细 胞，更优选地，ffiK细胞。在第三个目的中，本专利技术提供了用于产生针对特定蛋白的单克隆抗体的方法，所述方法包括下述步骤a)用使用本专利技术的载体在其细胞表面表达特定蛋白的细胞去免疫非人动物，b)分离步骤a)的非人动物的脾细胞，c)将步骤b)的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，产生B细胞杂交瘤，以及d)鉴定表达针对特定蛋白的抗体的B细胞杂交瘤。在本专利技术的方法的一种优选的实施方式中，非人动物是小鼠或亚美尼亚仓鼠。“核酸表达载体”指能指导感兴趣的序列或基因表达的装配体。核酸表达载体包括与感兴趣的序列或基因有效相连的启动子。也可存在其它控制元件。此外，载体还可包括细菌复制起点、一种或多种可选择标志物、允许载体作为单链DNA存在的信号(例如M13复制起点)、多克隆位点和“哺乳动物”复制起点(例如SV40或腺病毒复制起点)。“载体”能将基因序列转移到靶细胞(例如病毒载体，非病毒载体，颗粒载体和脂质体)。载体用于将外来或异源DNA运送至合适的宿主细胞。一旦在宿主细胞中，载体可独立于宿主染色体DNA而复制，并且可产生载体及其插入的(外来)DNA的数个拷贝。术语“蛋白”在本文中使用时指氨基酸的聚合物，其不限于特定长度。因此，肽、寡肽和蛋白片段包括在的多肽的定义内。术语“单克隆抗体”在本文中使用时指从基本上同质的(substantiallyhomogeneous)抗体群获得的抗体，即，该群包含的各抗体除了可少量存在的可能的天然产生的突变之外是相同的。修饰词“单克隆”指从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，其不应被解释为需要通过任何特殊的方法来生产抗体。例如，将根据本专利技术使用的单克隆抗体可通过杂交瘤方法(首先由Kohler和Milstein(1975)Nature 256 :495描述的)来制造，或可通过重组DNA方法(见例如美国专利号No. 4，816，567 (Cabilly等人)，以及Mage和 Lamoyi(1987)于 Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp. 79-97, Marcel Dekker, Inc.，New York中)来制造。单克隆抗体还可分离自使用例如McCafferty等人(1990)Nature348 :552-554中描述的技术产生的噬菌体文库。附图简述图IA 显示了用于实施例中的人 ABCAl (Seq. Id. No. 7)、大鼠 TEMEM27 (Seq.Id. No. 9)和恶性疟原虫(P. falciparum)PFF0620c (Seq. Id. No. 11)蛋白的初级结构。用于所描述的构建体的结构域用斜线标示，并且指示了 N和C末端的氨基酸；图IB显示了源于实施例中描述的载体的被表达的蛋白构建体的示意图。细胞外结构域等同于图IA中显示的那些；图2显 示了使用来自经pANITA2-ABCAl和pANITA2_TMEM27转染的HEK293细胞的全细胞裂解物的抗FLAG M2-HRP缀合抗体(Sigma)进行的Western印迹。观察到具有恰当分子量条带的强烈表达；图3A显示了 PFF0620C在经稳定转染的HEK细胞上的细胞表面表达。未经转染的HEK细胞(第I行)和展示PFF0620C的HEK细胞(第2行)的荧光(第2和3列)和微分干涉差显微图(第I列)。在室玻片上培养细胞，无固定下以抗FLAG抗体和经FITC标记的抗小鼠IgG抗体染色。用DAPI染色核；图3B显示了经稳定转染的HEK细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.02 EP 10155115.81.用于蛋白的细胞表面表达的核酸表达载体，所述载体依序包含含有编码分泌信号肽的序列的多核苷酸序列、用于插入编码待表达蛋白的多核苷酸序列的克隆位点、和包含编码血型糖蛋白的跨膜结构域的序列的多核苷酸序列。2.权利要求I的核酸载体，其中所述血型糖蛋白的跨膜结构域是血型糖蛋白A的跨膜结构域。3.权利要求I或2的核酸载体，其中所述血型糖蛋白A的跨膜结构域是小鼠血型糖蛋白A跨膜结构域或亚美尼亚仓鼠血型糖蛋白A结构域。4.权利要求3的核酸载体，其中所述小鼠血型糖蛋白A结构域包含Seq.Id. No. I中公开的氨基酸，以及所述亚美尼亚仓鼠血型糖蛋白A结构域包含Seq. Id. No. 12中公开的氨基酸序列。5.权利要求1-4的核酸载体，其中所述分泌信号肽是蜂毒肽的分泌信号肽。6.权利要求5的核酸载体,其中所述蜂毒肽的分泌信号肽包含Seq.Id. No. 2中公开的氨基酸序列。7.权利要求1-6的核酸载体，其还在用于插入编码待表达蛋白的多核苷酸序列的克隆位点下游(3’ )包含编码FLAG标签的多核苷酸序列，所述标签包含Seq. Id. No. 3的氨基酸序列。8.权利要求1-7的核酸载体，其还在编码血型糖蛋白的跨膜结构域的多核苷酸序列下...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·比彻姆，A·德雷耶，H·马蒂勒，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：