本发明专利技术公开了一种骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体及重组细胞，首先构建含有靶向Myostatin基因的pre-miRNA和MYL1基因启动子的骨骼肌特异性miRNA表达载体pmiR-MNM2，然后通过电转染法将外源性表达载体pmiR-MNM2导入红安格斯新生牛成纤维细胞并经G418筛选获得阳性细胞，进行PCR鉴定，证实目的基因整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组；将转染pmiR-MNM2的牛胎儿成纤维细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚，将这些胚胎移入受体牛的子宫，为生产具有双肌性状的红安格斯克隆牛奠定了坚实的基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于转基因克隆动物
，涉及转基因克隆胚的核供体细胞的构建，特别涉及一种骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体及重组细胞。
技术介绍
Myostatin是骨骼肌生长发育的负调控因子，Myostatin基因(MSTN gene)的自然突变使肉牛、猪、绵羊等动物的骨骼肌呈现过度发育的双肌表型。Myostatin敲除的小鼠其肌肉量是野生型小鼠的2-3倍(McPherron, Lawler, . et al. Regulationof skeletal muscle mass in mice by a new TGF-β superfamily member .Nature, 1997，387:83-90.)，因此，可以通过Myostatin基因失活的方法来生产具有高产肉性状的转基因家畜。现有的失活方法包括以下几种 I) Myostatin基因的缺失或变异通过使Myostatin缺失或变异可以使动物体的肌肉大量生长。McPherron等(McPherron, Lawler, . et al. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a newTGF-β superfamily member . Nature, 1997, 387:83-90.)报道肌抑素敲除鼠在青年期(2 5月龄)的肌肉量大约提高了 30%，并且纯合子鼠的增重几乎全部为肌纤维的增生和肥大。McPherron 等(McPherron AC, Lee SJ. 1997. Double muscling in cattle dueto mutations in the myostatin gene. Proc Natl Acad Sci USA 94:12457-12461.)发现肌抑素缺失突变对鼠肌肉量影响较牛明显。张蕾(Zhang，L.，Yang, X.，An, X.，Chen, Y.,2007. Myostatin gene targeting in cultured China Han ovine myoblast cells.Animal I, 1401-1408)等通过基因打靶的方法对绵羊骨骼肌细胞的Myostatin基因进行的敲除，发现阳性细胞的Myostatin蛋白表达量较阴性对照明显降低。Myostatin缺失变异可提高肌肉量并改善饲料利用效率，野生型的Myostatin前肽在体内是异变的，当注射它在BMP -1 / T LD家族的金属蛋白酶的切割位点的突变体到正常小鼠或杂合子小鼠时其在增加肌肉量上有很强的作用(Bogdanovich V, Pogrebniak SG. 2009. . LikSprava:92-97. Wolfman NM, McPherron AC, Pappano WN, Davies MV, Song K, TomkinsonKN, Wright JF, Zhao L,Sebald SM, Greenspan DS, Lee SJ. 2003. Activation of latentmyostatin by the BMP-I/tolloid family of metalloproteinases. Proc Natl Acad SciUSA 100:15842-15846.)。2)肌肉生长抑制素抗体用肌肉生长抑制素特异性抗体来抑制肌肉生长抑制素活性。Whittemore等将肌肉生长抑制素的抑制剂JA16单克隆抗体给予5 8周龄的C57B1/6正常成年鼠，结果发现成年鼠的体重比对照抗抗体处理组鼠的体重约提高了 10%(Whittemore LA, Song K, LiX, et al. , Inhibition of myostatin in adult mice increases skeletal muscle massand strength . Biochem Biophys Res Commun，2003，300:965-971.)。Murphy 等报道直接阻断Myostatin的抗体可以增加21月龄的小鼠骨骼肌的质量(Murphy KTj KoopmanRj et al. Antibody-directed myostatin inhibition in 21-mo-old mice reveals novelroles for myostatin signaling in skeletal muscle structure and function. FASEBJ, 2010，24:4433-4442.，Murphy等得出Myostatin中和抗体不仅能够促进肌肉质量的增加而且能够提高肥胖的胰岛素抑制ob/ob小鼠葡萄糖的耐受力和脂肪量(BernardoBLj Wachtmann TSj Cosgrove PG，Kuhn M，Opsahl AC，Judkins KM，Freeman TB，HadcockJRjLeBrasseur NK. 2010. Postnatal PPARdelta activation and myo statin inhibitionexert distinct yet complimentary effects on the metabolic profile of obeseinsulin-resistant mice. PLoS One 5:ell307.) 0Kim等(Kim YS，Bobbili NK，Lee YKj JinHJj Dunn MA. 2007. Production of a polyclonal anti-myostatin antibody and theeffects of in ovo administration of the antibody on posthatch broiler growthand muscle mass.)制备了 Myostatin的单克隆抗体和多克隆抗体并将其注射到肉鸡卵黄 中，发现孵化后的肉鸡肌肉和体重显著增加。3)卵泡抑制素及其相关蛋白FLRG和GASP卵泡抑制素是一种分泌型的蛋白，它是Myostatin基因的拮抗剂，它能够在很多组织中表达。卵泡抑制素能够与许多TGF-β家族的成员相互结合，并抑制其功能。卵泡抑制素过表达能够促进肌肉质量大量增加，卵泡抑制素过表达动物骨骼肌比Myostatin基因敲除动物的骨豁肌更加强壮(Gilson H, Schakman 0，Kalista S，Lause P，TsuchidaK，Thissen JP. 2009. Follistatin induces muscle hypertrophy through satellitecell proliferation and inhibition of both myostatin and activin. Am J PhysiolEndocrinol Metab 297:E157_164.)。卵泡抑素在体外能抑制Myostatin的活性，在体内通过调节Myostatin活性可以促进肌肉的生长(Lee SJj Mc本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体，其特征在于，包括MYL1启动子，在MYL1？2启动子的下游设有针对Myostatin基因进行干扰的干扰序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑艳玲，张涌，权富生，王勇胜，刘军，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，杨凌科元克隆股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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