一种基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法技术方案

一种基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法，属于大肠杆菌表达调控领域。本发明专利技术利用基因工程技术，以细菌来源的普鲁兰酶为表达蛋白，构建了表达普鲁兰酶的重组大肠杆菌。通过使用含有lac操纵子和阻遏物基因lacI的pET表达载体pET-22b(+)和pET-28a(+)，构建了重组菌E.coliBL21/pET-22b(+)-pul和E.coliBL21/pET-28a(+)-PelB-pul，利用lac操纵子严谨的双阻遏调控策略，基本消除了毒性外源蛋白的本底表达，提高了冷冻甘油菌种的表达稳定性和乳糖自诱导后的目标蛋白表达量，增强了大肠杆菌表达系统稳定性。本发明专利技术解决了大肠杆菌T7表达系统中常见的系统稳定性问题，开发了增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法，属于大肠杆菌表达调控领域。本专利技术利用基因工程技术，以细菌来源的普鲁兰酶为表达蛋白，构建了表达普鲁兰酶的重组大肠杆菌。通过使用含有lac操纵子和阻遏物基因lacI的pET表达载体pET-22b(+)和pET-28a(+)，构建了重组菌E.coliBL21/pET-22b(+)-pul和E.coliBL21/pET-28a(+)-PelB-pul，利用lac操纵子严谨的双阻遏调控策略，基本消除了毒性外源蛋白的本底表达，提高了冷冻甘油菌种的表达稳定性和乳糖自诱导后的目标蛋白表达量，增强了大肠杆菌表达系统稳定性。本专利技术解决了大肠杆菌T7表达系统中常见的系统稳定性问题，开发了增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法。【专利说明】—种基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法
—种基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法,属于大肠杆菌表达调控领域。
技术介绍
重组技术已广泛用于目标蛋白的高水平表达。在多种可用于异源蛋白表达的系统中，大肠杆菌系统始终是最常用的表达宿主。与其他表达宿主相比，大肠杆菌具有众多优势，如遗传背景清楚、生长迅速、可在价格低廉的培养基中达到高密度和拥有过量表达目标蛋白的能力。基于T7 RNA聚合酶的T7系统表达的目标蛋白量可高达细胞总蛋白量的50%，因此显示了与其他大肠杆菌系统的优势。T7 RNA聚合酶合成mRNA的速度是大肠杆菌自身RNA聚合酶的5倍，其高活力赋予了 T7系统强大的合成重组蛋白的能力。但T7 RNA聚合酶的高活力已被证明了对表达系统存在一些负面作用，主要表现为:虽然T7 RNA聚合酶的编码基因，位于大肠杆菌宿主BL21(DE3)染色体上的T7基因受到7acUV5启动子和Iac操纵子序列的调控，只有极少量的T7RNA聚合酶“渗漏”表达，但由于T7 RNA聚合酶活力过高，即使没有诱导物存在，目标基因的转录也能被引发，产生本底表达。如果目标蛋白对大肠杆菌细胞有毒性，这种本底表达将会影响表达系统的稳定性和目标蛋白的正常表达，甚至表达菌株可能不稳定或积累有害突变。已有一些研究致力于减少大肠杆菌T7表达系统的本底表达。一种减少本底表达的方法是使用含有与PET载体兼容的pLysS或pLysE质粒的宿主菌。这两种载体表达的T7溶菌酶，是T7 RNA聚合酶的天然抑制剂，能与T7 RNA聚合酶结合并抑制后者的活性。然而，虽然BL21 (DE3) pLysS菌株的本底表达水平几乎只有BL21 (DE3)菌株的十分之一，但前者的本底表达依然存在，并且依然可能引起系统不稳定的问题。而且，T7溶菌酶是一种双功能的蛋白，它对大肠杆菌细胞壁具有破坏作用，因此含有PLysS或pLysE质粒的菌株生长较慢。另外诱导后，T7溶菌酶将减弱表达，使目标蛋白表达量很低。向培养基中添加0.5-1%葡萄糖，产生的代谢阻遏效应也能够降低T7 RNA聚合酶的本底表达。以上的方法都是直接针对T7 RNA聚合酶的本底表达而设计的，目标都是减少T7RNA聚合酶的本底表达。本专利技术开发出一种不直接减弱T7 RNA聚合酶的本底表达，但可以阻止T7 RNA聚合酶引发表达质粒上外源基因转录的方法。在pET载体的T7启动子下游插入Iac操纵子，形成TJ-1ac启动子，能有效地降低目标蛋白的本底表达。'l-lac启动子可提供一个he阻遏物的结合位点，当体系中不存在诱导物时，Iac阻遏物可紧紧地结合于Π-lac启动子的Iac操纵子序列上，阻止由本底表达产生的T7 RNA聚合酶通过，干扰了mRNA链的延伸，从而减少 外源基因在未诱导状态下的本底转录。如果系统中存在足够量的he阻遏物以占据细胞中所有的操纵子位点，未诱导细胞中目标蛋白的本底表达将几乎被完全地消除，表达系统也将获得稳定。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题 本专利技术的目的是提供增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法。本专利技术以细菌来源的普鲁兰酶为表达蛋白，使用了含有he操纵子和阻遏物基因IeicI的pET表达载体，利用Iac操纵子严谨的双阻遏调控策略，基本消除了毒性报道蛋白的本底表达，提高了大肠杆菌表达系统稳定性，从而开发了增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法。(二)技术方案 一种基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法，首先构建了表达长野芽胞杆菌naganoensis^ CCTCC M 2012388普鲁兰酶的重组大肠杆菌万.BL21 (DE3) / pET-20b (+) -pul，该重组菌携带的表达载体pET_20b (+)不含有Iac操纵子和阻遏物基因IacI。在诱导表达过程中发现报道蛋白存在本底表达，并且重组菌的冷冻甘油管在冻存过程中表达水平不断下降，表明表达系统存在不稳定的现象。因此使用含有Iac操纵子和阻遏物基因IacI的载体pET_22b (+)及pET_28a (+)，利用Iac操纵子严谨的双阻遏调控策略，构建了重组菌万.co7iBL21/ pET-22b (+)-pul和万.co7iBL21/pET-28a(+)-PelB- pul。比较了三株重组大肠杆菌的本底表达水平、冷冻甘油管表达量稳定性和乳糖自诱导后的目标蛋白表达量。( I)普鲁兰酶基因的获得 长野芽孢杆菌naganoensis) CCTCC M 2012388 培养基:CaCl2 0.25 g/L,MgSO4.7Η20 0.5 g/L, (NH4)2SO4 0.2 g/L，酵母提取物 2 g/L，无水葡萄糖 5 g/L, KH2PO4 3g/L,无机盐溶液I mL/L, pH 5.0,双蒸水配制。无机盐溶液=ZnSO4.7H20 0.1 g/L, MnCl2.H2O 0.03 g/L, H3BO3 0.3 g/L,CoCl2.6H20 0.2 g/L, CuCl2.2H20 0.01 g/L, NiCl2.6H20 0.02 g/L, Na2MoO4.2H20 0.03g/L,双蒸水配制。将长野芽孢杆菌UaciBw1S naganoensis) CCTCC M 2012388菌种接种于含有25mL培养基的250 mL摇瓶中，于37°C、200 rpm振荡培养72小时。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗漆两次，收集细胞利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA ExtractionMiniprep System (VIOGENE 公司)提取基因组。引物1:5，- gaacaGGATCCagatgggaacaccacaaaC _3，，引物 2:5，- attccctcgagtttaccatcagatgggct _3，。引物I含有BamHl限制性酶切位点，引物2含有Xho I限制性酶切位点。PCR 反应体系:ddH20 37 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L, dNTP(25 mmol/L)0.5yL，引物 I (50 pmol/μ L) I yL，引物 2 (50 pmol/μ L) I μ L，基因组 DNA 5 μ L，TaqDNA polymerase (5 U/μ L) 0.5 μ L。以长野芽孢杆菌naganoensis') CCTCC M 201238本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法，其特征在于：以来源于长野芽孢杆菌（Bacillus?naganoensis）CCTCC?M?2012388的普鲁兰酶为表达蛋白，使用含有lac操纵子和阻遏物基因lacI的pET表达载体pET?22b(+)及pET?28a(+)，利用lac操纵子严谨的双阻遏调控策略，构建了重组菌E.coliBL21/pET?22b(+)?pul及E.coliBL21/pET?28a(+)?PelB??pul，作为对照，构建了不含有lac操纵子和阻遏物基因lacI的表达系统E.coli?BL21(DE3)/?pET?20b(+)?pul；步骤为：???（1）普鲁兰酶基因的获得长野芽孢杆菌（Bacillus?naganoensis）CCTCC?M?2012388培养基：CaCl2?0.25?g/L，MgSO4·7H2O?0.5?g/L，（NH4）2SO4?0.2?g/L，酵母提取物?2?g/L，无水葡萄糖?5?g/L，KH2PO4?3?g/L，无机盐溶液1?mL/L，pH?5.0，双蒸水配制；无机盐溶液：ZnSO4·7H2O?0.1?g/L，MnCl2·H2O?0.03?g/L，H3BO3?0.3?g/L，CoCl2·6H2O?0.2?g/L，CuCl2·2H2O?0.01?g/L，NiCl2·6H2O?0.02?g/L，Na2MoO4·2H2O?0.03?g/L，双蒸水配制；将长野芽孢杆菌（Bacillus?naganoensis）CCTCC?M?2012388菌种接种于含有25?mL培养基的250?mL摇瓶中，于37℃、200?rpm振荡培养72?小时，培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用VIOGENE公司的基因组DNA提取试剂盒Genomic?DNA?Extraction?Miniprep?System提取基因组；引物1：5’??gaa?caG?GAT?CCa?gat?ggg?aac?acc?aca?aaC??3’，引物2：5’??att?ccc?tcg?agt?tta?cca?tca?gat?ggg?ct??3’；引物1含有BamHI限制性酶切位点，引物2含有XhoI限制性酶切位点；PCR反应体系：ddH2O?37?μL，10×Reaction?Buffer?5?μL，25?mmol/L?的dNTP?0.5?μL，50?pmol/μL的引物1?1?μL，50?pmol/μL的引物2?1?μL，基因组DNA?5?μL，5?U/μL的?Taq?DNA?polymerase?0.5?μL；以长野芽孢杆菌CCTCC?M?2012388基因组为模板，采用PCR方法扩增普鲁兰酶基因，PCR反应过程：95℃预变性5?min；95℃?1?min、60℃?0.5?min、72℃?2?min，进行30个循环；72℃延伸10?min；利用上海申能博彩生物科技有限公司的3S?Spin?Agarose?Gel?DNA?Purification?Kit纯化DNA片断；DNA溶液中加入1/10体积的pH?5.2、3?mol/L的乙酸钠溶液和2倍体积无水乙醇，?20℃沉淀1小时，12000?rpm于4℃离心30?min，加入75%乙醇500?μL洗涤，12000?rpm于4℃离心30?min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，立即使用或?20℃保存；（2）含有普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建a、pET?20b(+)?pul的构建利用北京博大泰克生物基因技术有限公司的质粒提取试剂盒Mini?Plasmid?Rapid?Isolation?Kit提取质粒pET?20b(+)；按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2秒钟使液体集中于管底，37℃水浴3小时，在管中加入1/10体积的Loading?Buffer或将管置于65℃保温10分钟，终止酶切反应，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩；反应体系组成：10×H?Buffer?4?μL，DNA?10?μL，BamHI?2?μL，XhoI?2?μL，ddH2O将体系补足40?μL；目的基因与质粒pET?20b(+)的连接将普鲁兰酶基因与质粒pET?20b(+)连接，反应体系组成如下：质粒pET?20b(+)?0.8?μL，普鲁兰酶基因4.2?μL，Ligation?Solution?5?μL；混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接反应12小时；重组质粒转化大...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：聂尧，徐岩，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：