本发明专利技术公开一种乳糖代替IPTG作为诱导剂诱导pET28a载体生产重组鸡α干扰素的方法。对乳糖诱导的时机、乳糖浓度、诱导持续时间条件进行研究，确定了乳糖诱导的最佳条件。结果表明，乳糖能有效地诱导重组α干扰素表达的表达，并且目的蛋白的表达量高于IPTG的诱导量。生产成本降低10%左右，菌体量提高20%，同时乳糖不会对环境造成污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程药物制备领域，更具体地，本专利技术涉及一种利用乳糖代替IPTG生产重组鸡α干扰素的方法。
技术介绍
干扰素(interfeixm，IFN)是一类重要的细胞因子，具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖、免疫调节等多种生物活性。动物机体受到病毒感染后干扰素从细胞内释放出来，可保护与其接触的其他细胞不受感染。由于天然干扰素在生物体内含量少且不易提取，在应用中受到限制。20世纪70年代起，科学家开始探索利用基因工程的方法来改造干扰素及其表达系统，取得了很大进步。在我国，禽类干扰素的研究起步比较晚。目前，市售的干扰素价格高昂，与动物价格低廉存在着尖锐的矛盾，无法在兽医临床上广泛应用。利用基因工程技术选择一个合适的系统，使其得到高效表达，生产具有廉价、广谱抗病毒活性、无毒害、无残留等优点的干扰素无疑是促使干扰素在兽医临床上推广应用的有效途径。目前工业生产中大多使用大肠杆菌作为工程菌来生产目的蛋白。大肠杆菌作为工程菌表达目的蛋白主要有两个优势一是大肠杆菌具有遗传背景清楚，易于控制基因的表达；二是大肠杆菌容易培养，可以获得较高产量的目的蛋白。乳糖(Lac)操纵子是研究的最为详尽的大肠杆菌基因操纵子，目前利用乳糖操纵子调控机理为基础设计和构建的表达系统已得到了广泛应用。Novagen公司的pET系列大肠杆菌表达体系利用IPTG诱导lacUV5启动子来过量表达T7RNA聚合酶，从而产生大量的目的蛋白。IPTG可作为乳糖操纵子的安慰性诱导剂，且不会被菌体所分解利用，不会带来复杂的代谢动力学影响，但其价格昂贵又有潜在毒性，而乳糖具备无毒和价廉的优点，使得其在重组蛋白的大规模发酵生产中，具有潜在价值和优势。本试验选用乳糖作为诱导剂探索其对干扰素蛋白诱导表达的最优化条件。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是利用基因重组技术，构建了含鸡α干扰素的重组质粒，克服了天然干扰素在体内含量少且不易提取等缺点，为鸡α干扰素的大规模生产奠定了基础。本专利技术的另一目的是克服了现有技术的缺陷和不足之处，提供一种利用乳糖诱导性表达载体生产重组鸡α干扰素的方法。本专利技术的目的是由以下技术方案实现的 (I)将已构建好含鸡α干扰素的重组质粒的宿主菌进行活化，制备种子液。(2)乳糖最佳诱导浓度确定以小三角瓶培养菌体，分别向处于最佳生长期的菌体培养基中加入乳糖，使乳糖终浓度分别为O. 5%、1%、2%、4%、8%，同时以加入O. 2mM/L的IPTG作为阳性对照，37°C，250rpm振荡培养4h，同时用未诱导的菌液作为阴性对照。(3)菌体最佳诱导时机确定菌体生长情况以0D_值来确定。以小三角瓶培养菌体，分别在菌体生长至OD600值为O. 4,0. 6,0. 8、1. O、1. 2、1. 4、1. 6时，向培养基中加入浓度为2%的乳糖，37°C诱导4h后，目的蛋白表达情况以诱导后的菌体全蛋白进行SDS-PAGE电泳，通过凝胶成像系统进行目的蛋白占总蛋白的比例的分析。(4)乳糖最佳诱导时间确定根据以上试验所确定的条件，在小三角瓶培养的菌体中加入乳糖进行诱导，于37°C分别诱导1、2、3、4、6、8、IOh，观察目的蛋白的表达量。本专利技术的优点在于 (I)本专利技术成功运用乳糖代替IPTG作为诱导剂来诱导目的蛋白的表达。(2)通过本专利技术所述的技术方案，大肠杆菌BL21 (DE3)菌体得率高，菌体湿重达40-80g/L。(3)本专利技术的目的蛋白表达水平高，目的蛋白占菌体总蛋白的水平可达11-15%，与IPTG诱导水平相当。(4)本专利技术利用乳糖诱导蛋白表达外，它还能大幅提高菌的生物量。(5)本专利技术所述的发酵方法简便，发酵时间短，生产成本低，此外，无IPTG存在，后处理简单。附图说明图1，不同乳糖浓度和IPTG诱导后的蛋白表达情况，其中泳道M为蛋白Marker，泳道1-7依次分别为未诱导、O. 2mMIPTG诱导、O. 5%乳糖诱导、1%乳糖诱导、2%乳糖诱导、4%乳糖诱导、8%乳糖诱导。图2，添加乳糖诱导不同时间的蛋白表达情况,其中泳道M为蛋白Marker，泳道I_8依次分别为添加乳糖诱导0h，lh, 2h, 3h, 4h, 6h, 8h, IOh。图3，不同菌体生长阶段加入乳糖诱导的目的蛋白占全菌总蛋白的比例。图4，干扰素浓度测定标准曲线图。具体实施例方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步详细的描述。实施例1 鸡α干扰素重组质粒的构建 参照NCBI中已发表鸡α干扰素基因序列(ΑΒ021154)，利用Primer Premier 5. O软件设计2对引物，用于扩增鸡IFN-α全基因(CKF1和CKR1)和去信号肽的成熟蛋白编码基因(CKF2和CKR2)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。权利要求1.一种乳糖代替IPTG诱导重组鸡α干扰素在大肠杆菌中的表达，其特征在于包括如下步骤(1)种子培养方法从-70°C冰箱中取出含鸡α干扰素重组质粒的甘油保藏管I支，于冰水浴中解冻，混匀后以1%接种量转接到50mlLB培养基中，在37°C的恒温摇床中振荡培养 12h，转速为 200r/min;(2)发酵和诱导将经活化的种子液按1%的接种量接种于2L培养基中，37°C恒温摇床中振荡培养，转速为200r/min，当菌体浓度达到一定OD值时，添加诱导剂乳糖，分别调整诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间因素进行发酵培养，以诱导后目的蛋白的浓度作为依据，确定最佳诱导方案。2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于所述的宿主菌为大肠杆菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3)，表达载体为 PET28a。3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于菌体浓度分别为OD6tltl为O.4-1. 6时添加诱导剂。4.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于用Bradford法测定蛋白质浓度，以牛血清白蛋白作为标准蛋白。全文摘要本专利技术公开一种乳糖代替IPTG作为诱导剂诱导pET28a载体生产重组鸡α干扰素的方法。对乳糖诱导的时机、乳糖浓度、诱导持续时间条件进行研究，确定了乳糖诱导的最佳条件。结果表明，乳糖能有效地诱导重组α干扰素表达的表达，并且目的蛋白的表达量高于IPTG的诱导量。生产成本降低10%左右，菌体量提高20%，同时乳糖不会对环境造成污染。文档编号C12P21/02GK102994596SQ201210528728公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日专利技术者马仲彬, 徐公豹, 李炳志, 李秋霞, 申艳敏, 王兴涛, 王新娟 申请人:河南省康星药业股份有限公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乳糖代替IPTG诱导重组鸡α干扰素在大肠杆菌中的表达，其特征在于包括如下步骤：（1）种子培养方法：从?70℃冰箱中取出含鸡α干扰素重组质粒的甘油保藏管1支，于冰水浴中解冻，混匀后以1%接种量转接到50mlLB培养基中，在37℃的恒温摇床中振荡培养12h，转速为200r/min;（2）发酵和诱导：将经活化的种子液按1%的接种量接种于2L培养基中，37℃恒温摇床中振荡培养，转速为200r/min,当菌体浓度达到一定OD值时，添加诱导剂乳糖,分别调整诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间因素进行发酵培养，以诱导后目的蛋白的浓度作为依据，确定最佳诱导方案。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马仲彬，徐公豹，李炳志，李秋霞，申艳敏，王兴涛，王新娟，
申请(专利权)人：河南省康星药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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