一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，包括以下步骤：根据鼠李糖脂合成酶RhlAB基因序列，设计扩增RhlAB基因的引物，以野生型产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的染色体为模板，进行PCR反应扩增RhlAB基因，并应用纯化试剂盒对目的基因切胶回收纯化，将纯化得到的RhlAB基因酶切转入大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体pAK1900中，获得新的质粒pAK1900-AB，将构建好的表达载体pAK1900-AB，采用热激法转化的方法导入受体菌铜绿假单胞菌感受态细胞中，涂布羧苄抗性平板，PCR验证所构建工程菌；摇瓶发酵，采用硫酸-蒽酮法测定鼠李糖脂的产量，极大降低了鼠李糖脂的生产成本，为鼠李糖脂的工业化应用奠定了基础，具有促使鼠李糖脂高产的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因 重组方法。
技术介绍
鼠李糖脂是一种糖脂类的阴离子表面活性剂，它具有良好的生物相容性和高效的 乳化、增溶以及降低表面张力等能力，在石油开采，生物医药、环境污染物的去除以及食品 加工等领域具有广泛的应用前景。目前，鼠李糖脂的生产菌株主要是铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)，其 生产性能的提高一般是通过各种理化诱变技术来提高菌株生产鼠李糖脂的能力，而理化诱 变极易回复突变，造成菌株生产性能的不稳定，1994年研宄发现参与鼠李糖脂合成的基因 rhlA和rhlB，认为它们是合成鼠李糖脂所必需的糖基转移酶基因，2003年进一步研宄确定 了 RhlA是酰基转移酶，是合成HAA (烷基酰酸）所必需的，而HAA ( 0 -羟基癸酰-0 -羟基 癸酸）和TDP-鼠李糖是合成鼠李糖脂的前体物质，同时HAA也是一种胞外生物表面活性物 质，RhlB是催化TDP-鼠李糖与HAA反应生成含有一个鼠李糖基的鼠李糖脂的关键基因，在 铜绿假单胞菌中rhlAB是以操纵子的形式存在的，在这一操纵子下，一共可以编码三个蛋 白，RhlA、RhlB和RhlR，这三个基因都有自己的终止密码子，但是由于在其起动子前存在核 糖体结合位点，从而使得下一个基因得到表达，我们可以利用这一特点直接将其中的RhlAB 基因扩增并在其它的细菌种类中进行表达。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种铜绿假单胞菌高产鼠李 糖脂的基因重组方法，通过扩增鼠李糖脂合成酶基因RhlAB，将其转入大肠杆菌-铜绿假单 胞菌穿梭质粒PAK1900中，获得新质粒pAK1900-AB ;将构建好的表达载体pAK1900-AB导入 铜绿假单胞菌中，具有促使鼠李糖脂的高产的特点。 为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为： ，其特征在于，包括以下步骤： 1) 根据鼠李糖脂合成酶RhlAB基因序列，设计用于扩增RhlAB基因（含鼠李糖基转移 酶自身启动子和结构基因RhlA，RhlB)的引物，为WA :3' -gaatcgaattcatgcggccgaaagtct gt-5'， WB ： ：3? - cggtaagctttcaggacgcagccttcagcc-5,； 2) 以野生型产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的染色体为模板，进行PCR反应扩增RhlAB基 因，反应结束后，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测其大小和纯度，并应用纯化试剂 盒对目的基因切胶回收纯化； 3) 将纯化得到的RhlAB基因酶切转入大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体pAK1900 中，获得新的质粒PAK1900-AB ; 4) 将构建好的表达载体PAK1900-AB，采用热激法转化的方法导入受体菌铜绿假单胞菌 感受态细胞中，涂布羧苄抗性平板，PCR验证所构建工程菌； 5) 摇瓶发酵，取200 yL铜绿假单胞菌工程菌接入种子培养基（20mL/200mL锥形 瓶），于37°C、180 r/min条件下摇瓶培养12h，然后以10%接种量（v/v)接入发酵培养 基（200mL/500mL锥形瓶），温度为37°C、转速180r/min，发酵时间为7d; 6) 采用硫酸-蒽酮法测定鼠李糖脂的产量。 所述的染色体模板采用野生型产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌(保藏编号：CCTCC NO : M2011287)。 所述的PCR反应扩增RhlAB基因的反应条件为：94 °C预变性5 min，30个循环 (94 °C，0.5 min;50 °C，0.5 min;68 °C，1 min)，最后在 68 °C条件下延伸 10 min。 所述的受体采用菌铜绿假单胞菌(保藏编号：CCTCC NO :M2011287)，将铜绿假单胞 菌贮存菌液在无抗的LB平板划线，37°C培养，从37° C (16-20h)培养平皿内挑取单菌落， 接种于5毫升LB的30毫升灭菌试管中，于37° C下振荡培养，按1% (v/v)接入新鲜的LB 液体培养基，取2ml接种于200mlLB培养基中，37° C下200rpm振荡培养2-2. 5小时0D600 为0. 3-0. 5左右，将菌液加入事先预冷的无菌离心管中，冰上放置lOmin后，4°C，4000rpm， 离心10min收集对数期细胞，弃上清，再将菌体悬浮于1/10体积（20ml)的无菌、预冷的终浓 度为 20mmol/L 的 CaC12 和 80mmol/L 的 MgC12 溶液中，4°C，3, 500rpm，离心 lOmin ;弃上清， 再将菌体悬浮于2ml的预冷的0. lmol/L的无菌CaC12溶液中，为感受态细胞，分装于1. 5ml 的Eppendorf管中，200 y 1/支，加入无菌甘油，使甘油最终含量达到15-20%，于-80°C冰箱 中冻存。 所述的热激法转化采用每100ML感受态细胞中加入5-10 ML连接液，冰浴30min， 42 °C热激45s，冰浴lmin，加入600-800ML LB培养基，于37 °C摇床培养lh，以使细菌复苏， 并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。 所述的硫酸-蒽酮法测定通过分别吸取稀释500倍的菌株发酵液1. 0 mL于干净试 管中，冰水浴中加入4 mL 0.2%的硫酸-蒽酮溶液，混匀后置于沸水浴（100°C)中15 min， 取出后自然冷却，以蒸馏水做空白对照，用酶标仪测定620nm的吸光值，根据已测得的鼠李 糖标准曲线，计算野生型铜绿假单胞菌和其工程菌株发酵液中鼠李糖脂含量，计算公式如 下：【主权项】1. ，其特征在于，包括以下步骤： 1) 根据鼠李糖脂合成酶RhlAB基因序列，设计用于扩增RhlAB基因（含鼠李糖基转移 酶自身启动子和结构基因 RhlA，RhlB)的引物，为WA :3' -gaatcgaattcatgcggccgaaagtct gt-5'， WB ： ：3? - cggtaagctttcaggacgcagccttcagcc-5,； 2) 以野生型产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的染色体为模板，进行PCR反应扩增RhlAB基 因，反应结束后，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测其大小和纯度，并应用纯化试剂 盒对目的基因切胶回收纯化； 3) 将纯化得到的RhlAB基因酶切转入大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体pAK1900 中，获得新的质粒PAK1900-AB ; 4) 将构建好的表达载体PAK1900-AB，采用热激法转化的方法导入受体菌铜绿假单胞菌 感受态细胞中，涂布羧苄抗性平板，PCR验证所构建工程菌； 5) 摇瓶发酵，取200 yL铜绿假单胞菌工程菌接入种子培养基（20mL/200mL锥形 瓶），于37°C、180 r/min条件下摇瓶培养12h，然后以10%接种量（v/v)接入发酵培养 基（200mL/500mL锥形瓶），温度为37°C、转速180r/min，发酵时间为7d; 6) 采用硫酸-蒽酮法测定鼠李糖脂的产量。2. 根据权利要求1所述的，其特征 在于，所述的染色体模板采用野生型产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌(保藏编号：CCTCC NO: M2011287)。3. 根据权利要求1所述的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，其特征在于，包括以下步骤：1)根据鼠李糖脂合成酶RhlAB基因序列，设计用于扩增RhlAB基因(含鼠李糖基转移酶自身启动子和结构基因RhlA，RhlB)的引物，为WA：3’‑gaatcgaattcatgcggccgaaagtctgt‑5’，WB：：3’‑ cggtaagctttcaggacgcagccttcagcc‑5’；2)以野生型产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的染色体为模板，进行PCR反应扩增RhlAB基因，反应结束后，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测其大小和纯度，并应用纯化试剂盒对目的基因切胶回收纯化；3) 将纯化得到的RhlAB基因酶切转入大肠杆菌‑铜绿假单胞菌穿梭表达载体pAK1900中，获得新的质粒pAK1900‑AB；4）将构建好的表达载体pAK1900‑AB，采用热激法转化的方法导入受体菌铜绿假单胞菌感受态细胞中，涂布羧苄抗性平板，PCR验证所构建工程菌；5) 摇瓶发酵，取 200 μL 铜绿假单胞菌工程菌接入种子培养基(20mL/200mL 锥形瓶) ，于37℃、180 r/min 条件下摇瓶培养12h，然后以 10% 接种量 (v/v)接入发酵培养基 (200mL/500mL 锥形瓶) ，温度为37℃、转速180 r/min，发酵时间为7d；6)采用硫酸‑蒽酮法测定鼠李糖脂的产量。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙叶芳，陈新玲，薛姝雯，
申请(专利权)人：西安海格生物技术研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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