本发明专利技术提供对铜绿假单胞菌具有抗菌性能的Magainin肽修饰物及其制备方法,所述Magainin肽为天然肽Magainin I或Magainin II，按C端到N端的顺序Magainin肽的23位甘氨酸与序列K(nph)KK2(β-Ala-NH2)4中的6-（4-吗啉-1，8-萘酰亚胺）-赖氨酸连接，即：M-MGN-I或M-MGN-II。所述两种新型的Magainin肽修饰物M-MGN-I和M-MGN-II，能够具有优良的广谱抗菌效果，尤其对对感染细胞或或活体内的铜绿假单胞菌有良好的抗菌效果，且能够特异性的清除A549和HBE细胞中的铜绿假单胞菌。
【技术实现步骤摘要】
对铜绿假单胞菌具有抗菌性能的Magainin肽修饰物及其制备方法
本专利技术属于生物化学领域，具体涉及的是对铜绿假单胞菌有优异抗菌性能的Magainin肽修饰物及其制备方法。
技术介绍
抗菌肽（AntimicrobialPeptides）是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量为2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。抗菌肽通过破坏膜的完整性，使细胞内外屏障丧失，从而杀死细菌。抗菌肽因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，而被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。Magainin肽是1987年Zasloff等人从非洲爪蟾皮肤中提取的一类天然肽，主要包含MagaininI和MagaininII两种结构十分类似的肽。天然肽MagaininI氨基酸序列为：SKMIEGVFAKGFKGASHLFKGIG；天然肽MagaininII其氨基酸序列为：SNMIEGVFAKGFKKASHLFKGIG，Magainin肽具有广谱的抗微生物活性，对许多细菌、真菌、原虫具有杀灭效果，且具有一定的抗肿瘤效果。铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）广泛存在于自然界中，是一种可引起人类各种感染性疾病的条件致病菌。在一些慢性疾病和免疫功能低下以及侵入性治疗或严重创伤的患者中极易罹患该菌感染，是医院内感染的主要致病菌之一。从连续7年的NPRS(中国国家重症监护病房细菌耐药监测)研究统计的数字来看，从中国ICU(重症加强护理病房)分离出的致病菌中，铜绿假单胞的数量占第一位。铜绿假单胞菌作为条件致病菌之一可引起呼吸道感染、泌尿系统感染、伤口感染、菌血症等。近年来由于抗生素的广泛使用，铜绿假单胞菌对NCCLS(美国临床实验室标准化委员会)推荐的一线用药，如庆大霉素、头孢噻甲羧肟、哌拉西林等亦早己产生不同程度的耐药性，这就使得该菌的抗感染治疗越来越困难，克服铜绿假单胞菌耐药性问题是当务之急。专利公开号：1049166，由理查德·A·霍顿等人专利技术的一系列magainin肽取代类似物，虽然具有较好的抗菌活性但并不具有靶向清除细胞内细菌的能力。中国专利申请号：200810157206.X，200110085397.4公开的运用基因工程方法合成的蜂毒素-马盖宁肽杂合物也不具有靶向清除细胞内细菌的能力。因此，研制出新型的对铜绿假单胞菌等多耐药菌具有良好抗菌效果抗菌肽，具有十分重要的现实意义。
技术实现思路
为了克服上述缺点，本专利技术的目的在于提供对铜绿假单胞菌具有抗菌性能的Magainin肽修饰物及其制备方法，所述两种新型的Magainin肽修饰物M-MGN-I和M-MGN-II能够具有优良的广谱抗菌效果，尤其对对感染细胞或或活体内的铜绿假单胞菌有良好的抗菌效果，且能够特异性的清除A549和HBE细胞中的铜绿假单胞菌。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现：本专利技术提供对铜绿假单胞菌具有抗菌性能的Magainin肽修饰物,所述Magainin肽为天然肽MagaininI其氨基酸序列为SKMIEGVFAKGFKGASHLFKGIG，或天然肽MagaininII其氨基酸序列为SNMIEGVFAKGFKKASHLFKGIG，其特征在于：按C端到N端的顺序Magainin肽的23位甘氨酸与序列K(nph)KK2(β-Ala-NH2)4中的6-（4-吗啉-1，8-萘酰亚胺）-赖氨酸连接，即：M-MGN-I:HO-SKMIEGVFAKGFKGASHLFKGIGK(nph)KK2(β-Ala-NH2)4，M-MGN-II:HO-SNMIEGVFAKGFKKASHLFKGIGK(nph)KK2(β-Ala-NH2)4。所述M-MGN-I和M-MGN-IIN端增加了四个带正电的β-丙氨酸，使得N端的正电性增强，增强了“头基”效应，从而增强了抗菌性能。根据本专利技术所述的Magainin肽修饰物，所述序列K(nph)KK2(β-Ala-NH2)4的结构为：本专利技术所述荧光团为6-（4-吗啉-1，8-萘酰亚胺）-赖氨酸，能发射绿色荧光，主要用于荧光示踪。本专利技术还提供所述Magainin肽修饰物的制备方法，包括如下步骤：（1）采用固相Fmoc技术，将反应瓶中的羧基树脂和侧链带有保护基的Fmoc丝氨酸溶于DMF溶液，在有机碱和偶合剂存在下反应后，得到与侧链带有保护基的丝氨酸偶联的树脂；（2）将步骤（1）得到的侧链带有保护基的丝氨酸偶联的树脂放入微波多肽合成仪中，加入体积比1/4的六氢哌啶/DMF混合液，在微波作用下脱除Fmoc保护基团，然后加入有机碱二异丙基乙基氨、偶合剂和侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸或者侧链带有保护基的Fmoc天冬酰胺，微波反应后，得到进一步与侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸或者侧链带有保护基的天冬酰胺偶联的树脂；（3）依次重复步骤（2），其中原料氨基酸依次替换为Fmoc甲硫氨酸、Fmoc异亮氨酸、侧链带有保护基的Fmoc谷氨酸、Fmoc甘氨酸、Fmoc缬氨酸、Fmoc苯丙氨酸、Fmoc丙氨酸、侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸、Fmoc甘氨酸、Fmoc苯丙氨酸、侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸、Fmoc甘氨酸或者侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸、Fmoc丙氨酸、侧链带有保护基的Fmoc丝氨酸、侧链带有保护基的Fmoc组氨酸、Fmoc亮氨酸、Fmoc苯丙氨酸、侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸、Fmoc甘氨酸、Fmoc异亮氨酸，Fmoc甘氨酸，Fmoc6-（4-吗啉-1，8-萘酰亚胺）-赖氨酸、双Fmoc赖氨酸、双Fmoc赖氨酸、Fmoc-β-丙氨酸，脱除Fmoc保护基团，最终得到与上述氨基酸依次偶联的树脂；（4）切割步骤（3）所得与上述氨基酸依次偶联的树脂，得到化合物M-MGN-I:HO-SKMIEGVFAKGFKGASHLFKGIGK(nph)KK2(β-Ala-NH2)4，或者M-MGN-II:HO-SNMIEGVFAKGFKKASHLFKGIGK(nph)KK2(β-Ala-NH2)4。本专利技术所述Magainin肽修饰物的制备方法，优选的是，所述侧链带有保护基的Fmoc丝氨酸、侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸、侧链带有保护基的Fmoc天冬酰胺、侧链带有保护基的Fmoc谷氨酸、侧链带有保护基的Fmoc组氨酸依次为叔丁基保护的Fmoc丝氨酸、叔丁氧羰基保护的Fmoc赖氨酸、（三苯甲基保护的）Fmoc天冬酰胺、三苯甲基保护的Fmoc谷氨酸、叔丁氧羰基保护的Fmoc组氨酸。本专利技术所述Magainin肽修饰物的制备方法的切割过程中，同时去掉各氨基酸的侧连保护基团。本专利技术所述Magainin肽修饰物的制备方法的切割，采用三氟乙酸/三甲基硅烷/水以体积比95/2.5/2.5为混合切割3小时，得粗品。本专利技术所述Magainin肽修饰物的制备方法，优选的是，所述羧基树脂为2-氯三苯甲基氯树脂；所述有机碱为二异丙基乙基氨；所述偶合剂为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐。本专利技术所述Magainin肽修饰物的制备方法，优选的是，所述各种氨基酸与羧基树脂的摩尔比均为2～8/1。本专利技术所述Magainin肽修饰物的制备方法，进一步优选本文档来自技高网...
【技术保护点】
对铜绿假单胞菌具有抗菌性能的Magainin肽修饰物,所述Magainin肽为天然肽Magainin I，其氨基酸序列为SKMIEGVFAKGFKGASHLFKGIG，或天然肽Magainin II，其氨基酸序列为SNMIEGVFAKGFKKASHLFKGIG，其特征在于：按C端到N端的顺序Magainin肽的23位甘氨酸与序列K(nph)KK2(β‑Ala‑NH2)4中的6‑（4‑吗啉‑1，8‑萘酰亚胺）‑赖氨酸连接，即：M‑MGN‑I:HO‑SKMIEGVFAKGFKGASHLFKGIGK(nph)KK2(β‑Ala‑NH2)4，M‑MGN‑II:HO‑SNMIEGVFAKGFKKASHLFKGIGK(nph)KK2(β‑Ala‑NH2)4。
【技术特征摘要】
1.对铜绿假单胞菌具有抗菌性能的Magainin肽修饰物,所述Magainin肽为天然肽MagaininI，其氨基酸序列为SKMIEGVFAKGFKGASHLFKGIG，或天然肽MagaininII，其氨基酸序列为SNMIEGVFAKGFKKASHLFKGIG，其特征在于：按N端到C端的顺序Magainin肽的23位甘氨酸与序列K(nph)KK2(β-Ala-NH2)4中的6-(4-吗啉-1，8-萘酰亚胺)-赖氨酸连接，即：M-MGN-I:HO-SKMIEGVFAKGFKGASHLFKGIGK(nph)KK2(β-Ala-NH2)4，M-MGN-II:HO-SNMIEGVFAKGFKKASHLFKGIGK(nph)KK2(β-Ala-NH2)4。2.根据权利要求1所述的Magainin肽修饰物，其特征在于，所述序列K(nph)KK2(β-Ala-NH2)4的结构为：3.权利要求1所述Magainin肽修饰物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)采用固相Fmoc技术，将反应瓶中的羧基树脂和侧链带有保护基的Fmoc丝氨酸溶于DMF溶液，在有机碱和偶合剂存在下反应后，得到与侧链带有保护基的丝氨酸偶联的树脂；(2)将步骤(1)得到的侧链带有保护基的丝氨酸偶联的树脂放入微波多肽合成仪中，加入体积比1/4的六氢哌啶/DMF混合液，在微波作用下脱除Fmoc保护基团，然后加入有机碱、偶合剂和侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸或者侧链带有保护基的Fmoc天冬酰胺，微波反应后，得到进一步与侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸或者侧链带有保护基的天冬酰胺偶联的树脂；(3)依次重复步骤(2)，其中原料氨基酸依次替换为Fmoc甲硫氨酸、Fmoc异亮氨酸、侧链带有保护基的Fmoc谷氨酸、Fmoc甘氨酸、Fmoc缬氨酸、Fmoc苯丙氨酸、Fmoc丙氨酸、侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸、Fmoc甘氨酸、Fmoc苯丙氨酸、侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸、Fmoc甘氨酸或者侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸、Fmoc丙氨酸、侧链带有保护基的Fmoc丝氨酸、侧链带有保护基的Fmoc组氨酸、Fmoc亮氨酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴君臣，董理，朱玉，姚德帆，田禾，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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