大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测引物、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测引物、试剂盒和检测方法。本发明专利技术通过组合利用大肠杆菌碱性磷酸酶基因、铜绿假单胞菌外膜蛋白基因和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因序列分别设计特异性引物，利用该特异性引物按照本发明专利技术的方法对样品进行多重PCR检测，可一次实现对样品中的大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的特异性检测，检测耗时短、操作简便，可大大提高检测效率，适合快速检测的要求，且灵敏度高、特异性强，可应用于化妆品微生物检测工作中。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于微生物检测领域，具体涉及大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测引物、试剂盒和检测方法。
技术介绍
：化妆品含有营养丰富的蛋白质、脂肪、维生素、无机盐等，极利于微生物的生长和繁殖。微生物生长繁殖可引起化妆品腐败变质，还可产生毒素或代谢产物。这些异物作为变应原或刺激原可能会对使用部位产生致敏或刺激作用，引起各类型化妆品皮肤病，例如接触性皮炎、痤疮、毛发损害、光感性皮炎和皮肤色素异常等，因此，《化妆品卫生规范》(2007年版)中规定，每克或每毫升产品中不得检出粪大肠菌群、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，其中大肠杆菌是粪大肠菌群中与人类生活密切相关的一种菌，为人和温血动物肠道中的正常寄生细菌，作为粪便污染的最佳指示菌，大肠杆菌检出的意义最大。目前，检测化妆品中病原细菌的方法主要是细菌学培养，通常需经富集培养、形态观察、生理生化鉴定等过程，操作繁琐、耗时费力，而且一次只能检测一种病原细菌，难以满足快速检测的需求。而以PCR技术为代表的现代分子生物学方法，通过特异引物在热循环仪中对靶标基因片段进行指数倍增。信号放大，已成为病原菌快速检验的理想之选。多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型DNA扩增技术，是在同一反应体系中同时加入多对引物扩增多条目的DNA片段，采用这一技术可实现多种病原微生物的同时检测，该技术在食品、饮用水中已有应用，但在化妆品领域较少见，因此，迫切需要建立快速、高效、可同时检测多种病原微生物的化妆品微生物检测方法。
技术实现思路
：本专利技术利用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的特异性鉴别基因，分别设计了特异性引物，采用多重PCR技术对3种病原菌进行快速检测。通过对多重PCR检测体系的优化，开发了针对化妆品中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的多重PCR检测试剂盒；同时，结合前处理技术，建立了检测准确，高效的检测方法。本专利技术的第一个目的是提供一种大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测引物，其特征在于，所述的多重PCR检测引物如下所示：针对大肠杆菌phoA基因：phoA-F：5'-GTTTCTACCGCAGAGTTG-3'，phoA-R：5'-GACTATGACCAGCGTGTT-3'；针对铜绿假单胞菌oprL基因：oprL-F：5'-GGCGTGCTGATGCTCGTA-3'，oprL-R：5'-CGCTGACCGCTGCCTTTC-3'；针对金黄色葡萄球菌nuc基因：nuc-F：5'-ACATAAAGAACCTGCGAC-3'，nuc-R：5'-CATTTTTCCATCAGCATA-3'。本专利技术的第二个目的是提供一种大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重PCR检测试剂盒包含权利要求1所述的多重PCR检测引物。所述的多重PCR检测试剂盒还包括含Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP和TaqDNA聚合酶。本专利技术的第三个目的是提供上述的多重PCR检测引物或多重PCR检测试剂盒在检测大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌中的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种化妆品中大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：a)对待测的化妆品样品进行增菌培养，然后提取细菌的基因组DNA作为模板；b)利用权利要求1所述的多重PCR检测引物进行多重PCR扩增；c)检测多重PCR扩增产物，判断化妆品样品中是否存在大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。所述的步骤a)所述的对待测的化妆品样品进行增菌培养具体为将待测的化妆品样品接种到SCDLP增菌液中进行增菌培养，所述的SCDLP增菌液为：每升含有蛋白胨20g、牛肉膏3g、NaCl5g、K2HPO42.5g、葡萄糖3g、组氨酸4g、硫乙醇酸钠1g、卵磷脂2g和吐温-8010g，余量为蒸馏水，pH7.2～7.3。所述的多重PCR扩增的反应体系为：DNA模板1pg～100ng、含Mg2+的10×缓冲溶液10mM、dNTP0.2mM、TaqDNA聚合酶1.0U、上述的多重PCR检测引物phoA-F、phoA-R、oprL-F、oprL-R、nuc-F和nuc-R各0.5μM，加ddH2O至总体积为25μL；所述的多重PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性50s、54℃退火40s、72℃延伸1min20s，进行30个循环；72℃延伸10min。本专利技术的通过组合大肠杆菌碱性磷酸酶基因(phoA基因)、铜绿假单胞菌外膜蛋白基因(oprL基因)和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc基因)序列分别设计特异性引物，利用该特异性引物按照本专利技术的方法对样品进行多重PCR检测，可一次实现对样品中的大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的特异性检测，具有检测特异性强、灵敏度高、没有引物二聚体形成等优势，三对引物扩增DNA的灵敏度分别为1.59pg/μL、1.69pg/μL、1.34pg/μL。本专利技术提供的针对化妆品中大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测方法还具备检测操作简单、灵敏度高、特异性强，检测时间短等特点，与传统检测方法相比可大大节省检测成本和时间，提高检测的效率和准确性，具有广泛的市场应用前景，同时本专利技术的检测方法中设置了阳性对照和空白对照，保证了结果的准确性。附图说明：图1是3种病原菌单重PCR扩增结果，其中，M代表DNAmarker，1～7的模板为大肠杆菌ATCC8039、铜绿假单胞菌ATCC9027和金黄色葡萄球菌ATCC6538的总DNA，1的引物为phoA-F/phoA-R，2的引物为oprL-F/oprL-R，3的引物为nuc-F/nuc-R，4的引物为phoA-F/phoA-R和oprL-F/oprL-R，5的引物为phoA-F/phoA-R和nuc-F/nuc-R，6的引物为oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R，7的引物为phoA-F/phoA-R、oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R，8为空白对照。图2是引物phoA-F/phoA-R的灵敏度和特异性的扩增结果，其中，M代表DNAmarker，1～7的模板为大肠杆菌ATCC8039基因组DNA，1～7的模板终浓度分别为159.15ng/μL、15.915ng/μL、1.59ng/μL、159.15pg/μL、15.915pg/μL、1.59pg/μL和0.159pg/μL，8代表铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa，9代表金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus，10代表恶臭假单胞菌Pseudomonasputida，11代表荧光假单胞菌PseudomonasFluorescens，12代表洋葱伯克霍尔德菌Burkholderiacepacia，13代表表皮葡萄球菌Staphylococcusepidermidis，14代表腐生葡萄球菌Staphylococcussaprophytics，15代表嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonasmaltophilia，16代表肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测引物，其特征在于，所述的多重PCR检测引物如下所示：针对大肠杆菌phoA基因：phoA‑F：5'‑GTTTCTACCGCAGAGTTG‑3'，phoA‑R：5'‑GACTATGACCAGCGTGTT‑3'；针对铜绿假单胞菌oprL基因：oprL‑F：5'‑GGCGTGCTGATGCTCGTA‑3'，oprL‑R：5'‑CGCTGACCGCTGCCTTTC‑3'；针对金黄色葡萄球菌nuc基因：nuc‑F：5'‑ACATAAAGAACCTGCGAC‑3'，nuc‑R：5'‑CATTTTTCCATCAGCATA‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测引物，其特征在于，所述的多重PCR检测引物如下所示：针对大肠杆菌phoA基因：phoA-F：5'-GTTTCTACCGCAGAGTTG-3'，phoA-R：5'-GACTATGACCAGCGTGTT-3'；针对铜绿假单胞菌oprL基因：oprL-F：5'-GGCGTGCTGATGCTCGTA-3'，oprL-R：5'-CGCTGACCGCTGCCTTTC-3'；针对金黄色葡萄球菌nuc基因：nuc-F：5'-ACATAAAGAACCTGCGAC-3'，nuc-R：5'-CATTTTTCCATCAGCATA-3'。2.一种大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重PCR检测试剂盒包含权利要求1所述的多重PCR检测引物。3.根据权利要求2所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重PCR检测试剂盒还包括含Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP和TaqDNA聚合酶。4.权利要求1所述的多重PCR检测引物或权利要求2或3所述的多重PCR检测试剂盒在检测大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌中的应用。5.一种化妆品中大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：文霞，杨秀茳，谢小保，孙廷丽，周少璐，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东;44