rsmA基因在植物根表定殖和促生方面的应用制造技术

本发明专利技术首次发现了rsmA基因参与固氮施氏假单胞菌在植物根部定殖和促生方面的功能。研究表明，该基因的存在对微生物在根表的定向运动及高效定殖具有负调控作用，通过基因敲除、基因突变等有效手段使该基因的功能丧失后可以提高菌株在固体介质上的运动能力，并在植物根表产生更强的定殖能力，进而促进植物的生长。

【技术实现步骤摘要】
rsmA基因在植物根表定殖和促生方面的应用
本专利技术涉及rsmA基因在植物根表定殖和促生方面的应用。技术背景rsmA基因是在革兰氏阴性菌中广泛存在的转录后调节因子。在有些细菌的报道中，提到该基因参与微生物的中心碳代谢、菌体运动、生物膜及致病性等相关的生理过程，但是尚未见报道其在参与植物生长方面的功能。微生物菌肥中使用的微生物多是从植物根际分离到的植物根际促生菌(PGPR)，当这些促生菌在植物“根部定殖”，即在植物根表和近根土壤中稳定繁殖时，菌体可以利用植物根分泌的有机物作为碳源，例如有机酸，糖类，氨基酸等，这一独特的生态环境使得植物促生菌大量繁殖，形成非常高的菌密度，然后利用自身的生物固氮、溶磷解钾、分泌植物激素等方法促进植物生长的作用，实现植物-微生物互惠互利的高效共生关系。固氮施氏假单胞菌A1501是我国科学家分离到的一株联合固氮菌。但是在田间环境下存在的众多的土著微生物会与A1501竞争氮素、碳素等营养物质。因此，大幅提高固氮施氏假单胞菌A1501在植物根部的定殖能力，使其在众多的根际微生物中获得竞争优势，大量定殖到植物根表并发挥促生作用， 非常重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是寻找有关参与固氮施氏假单胞菌水稻根部定殖和促生相关的基因。本专利技术人在其实验室完成的A1501基因组中找到rsmA基因，该基因在A1501基因组中编号(Locus tag)为PST1371，对应的蛋白编码在NCBI数据库编号是ABP79066.1。本专利技术首次发现了 rsmA基因参与固氮施氏假单胞菌在植物根部定殖和促生方面的功能。研究表明，该基因的存在对微生物在根表的定向运动及高效定殖具有负调控作用，通过基因敲除、基因突变等有效手段使该基因的功能丧失后可以提闻菌株在固体介质上的运动能力，并在植物根表产生更强的定殖能力，进而促进植物的生长。即，rsmA基因作为负调控因子行使功能，当通过基因工程的手段使该基因的功能缺失后，获得的基因工程菌株具有更高的运动能力、生物膜合成能力以及更强的水稻根部定殖和促生能力。本专利技术涉及所述的突变菌的产生方法及其产生的菌株在微生物肥料产业中具有应用前景。基因组分析表明，在固氮施氏假单胞菌A1501中存在一个跟大肠杆菌csrA的氨基酸序列87%的相似度，和铜绿假单胞菌rsmA基因氨基酸序列同源性高达97%的类似物。我们通过同源重组的方法对固氮假单胞菌中的rsmA基因进行整合突变使其功能缺失。结果发现，突变株在固体培养基上菌落形态发生明显的变化，菌落变得干燥，不易从培养基上剥离。野生型A1501在含0.5%琼脂的LB平板上，几乎不发生swarm运动，但RsmA突变株的swarm运动能力极大的增强,此外，RsmA的突变导致了菌体生物薄膜生成量明显增加。此外，通过接种野生型及突变株菌株于水稻幼苗根部，结果发现，rsmA功能的缺失导致了固氮假单胞菌在水稻根部定殖能力和促生能力都大幅增强。本专利技术人通过对Pseudomonas stutzeri A1501的全基因组序列和基因注释分析，发现构建rsmA基因功能缺失的突变株可以用于生产增强固氮作用的微生物菌肥。上述构建rsmA基因功能缺失的突变株可以采用多种形式，如整合突变方式，也可以采用缺失突变，点突变等方式，只要能够使rsmA基因功能缺失就可以得到相似的表型和实验结果。在本专利技术的一个实例中，采用同源重组的方式对rsmA基因进行整合突变，获得了rsmA基因功能缺失突变株。本专利技术对所得到的上述rsmA突变株进行了如下测定，证明其可高效定殖水稻，小麦，玉米等禾本科农作物根部，并对植物有促生长作用:1)菌体 swarming 运动即，测定菌体在琼脂含量为0.4%-0.7%的半固体培养基表面上运动扩散，发现突变株在固体界面上的swarming运动能力显著增强，这可以导致菌体在水稻根表定殖后，通过swarming运动形式从定殖初始位点向周围扩张扩大定殖的面积，使菌体广泛占据植物的根表，获得更好的营养来源，在与其他土著微生物的竞争中占据先机。2)生物膜形成(细菌在固体表面形成一种具有一定三维空间结构的多细胞结构，被称为生物膜)，发现突变株生物膜的生成能力增强，证明rsmA的突变促进了施氏假单胞菌生物膜的形成。生物膜的形成对于固氮微生物是非常重要的，形成了生物膜这种特殊的结构，微生物的生长、固氮等多种生理反应才能够被激活并稳定进行。3)水稻根表竞争性定殖实验在突变株在和固氮假单胞菌A1501野生型的水稻根际竞争性定殖实验中，发现rsmA突变株的定殖能力高出野生型10倍以上；4)水稻促生实验在实验室环境下，采用野生型A1501及rsmA突变株接种水稻植株，在对水稻的促生效果上，无论水稻株高还是植株地上部分与地下部分的干重上都具有明显的优势。5)固氮酶活测定实验发现:rsmA突变株的固氮酶活相对于野生型虽然没有发生明显改变，说明rsmA的缺失对于固氮效率没有产生影响。【附图说明】图1是rsmA整合突变PCR验证，图中:M为trans2Kplus2DNA marker, I为利用pK18mobcon-F与rsmA下游-R为引物，rsmA插入突变株基因组为模板扩增出的800bp片段；图2是A1501野生型和rsmA突变株固氮酶活的测定；图3是A1501和rsmA突变株在固态培养基上的swarming能力测定，其中，图左是rsmA基因突变株图右是野生型A1501 ；图4是A1501和rsmA突变株生物膜生成能力测定对比，rsmA突变株形成的菌膜明显要比野生型的要厚。【具体实施方式】下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于举例说明本专利技术的方法，而不用于限制本专利技术的范围。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。实施例1以施氏假单胞菌A1501为出发菌株构建rsmA突变株本实验构建的rsmA突变株采用的是整合突变的方法。基本的原理为DNA同源重组。实验方法:(I):采用PCR扩增法获得截短的rsmA基因部分片段，命名为rsmA’，将rsmA’片段连接到PMD-19T克隆载体上，对rsmA’进行DNA测序，确保序列的真实性。(2):对rsmA’克隆载体进行限制性双酶切,将切下的rmsA’连接到pK18mob质粒上，获得rsmA’自杀质粒。(3):通过三亲结合方法,rsmA’自杀质粒导入到A1501中，利用A15限制性培养基和卡那霉素进行筛选。 (4):质粒上的rsmA’和A1501基因组上的rsmA发生同源单交换。利用pK18mob上的通用引物pK18mobconF和rsmA下游DNA片段的反向引物进行菌落PCR扩增。能扩增出大小约SOObp的条带的菌株已经发生了同源交换。实验结果:利用pK18mob上的通用引物pK18mobconF和rsmA下游DNA片段的反向引物进行菌落PCR扩增，能扩增出大小约SOObp的条带(如图1)。说明已经发生了同源交换，获得rsmA突变株。实施例2野生型A1501和rsmA突变株的swarming运动实验方法:(I)从LB平板上挑取新鲜活化的单菌落，接种到含20mL LB液体培养基的50mL三角瓶中，rsmA突变株培养基需要加入50 μ g/mL的卡那霉素，30°C，200rpm培养过夜。(2)吸取1%过夜本文档来自技高网...

【技术保护点】
rsmA基因在植物根表定殖和促生方面的应用，所述rsmA基因的编码蛋白在NCBI数据库编号是ABP79066.1。

【技术特征摘要】
1.rsmA基因在植物根表定殖和促生方面的应用，所述rsmA基因的编码蛋白在NCBI数据库编号是ABP79066.1。2.权利要求1所述的应用，是rsmA基因参与固氮施氏假单胞菌在植物根部定殖和促生方面的应用。3.权利要求1所述的应用，是rsmA基因的负调控功能的应用；所述负调控功能是:将该基因的功能缺失，使获得的基因工程菌株具有更高的运...

【专利技术属性】
技术研发人员：燕永亮，尚立国，战嵛华，林敏，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：