本发明专利技术涉及一种提高白细胞介素IL‑34热稳定性的方法，属于生物技术领域。所述方法通过对人源IL‑34cDNA中编码98号丝氨酸的密码子agc，定点突变为编码半胱氨酸的密码子tgt；将含有S98C IL‑34突变体编码序列的转移质粒与BacVector‑3000杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞来制备表达S98C IL‑34的杆状病毒；再使用杆状病毒转导HEK 293细胞表达S98C IL‑34。所述方法获得的S98C IL‑34与native IL‑34相比，热稳定性得到提升。经过M‑NFS‑60细胞增殖实验和CSF‑1R磷酸化实验，证明S98C IL‑34活性与native IL‑34没有显著差别。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种提高白细胞介素IL-34(interleukin-34，IL-34)热稳定性的方法，具体地说，涉及一种通过氨基酸定点突变提升IL-34热稳定性的方法，属于生物
技术介绍
白细胞介素-34(interleukin-34，IL-34)是一个新近发现的细胞因子(Haishan Lin et al.Science 2008)。它是集落刺激因子-1受体(colony-stimulating factor lreceptor，CSF-1R)的一个新配体，它能特异识别并独立激活CSF-1R。IL-34发挥生物活性的形式为二聚体形式，生物二聚体的分子量50KD，每个单体的分子量为25KD，单体的氨基酸序列为：IL-34自从被识别为CSF-1R的新配体以来，它的功能以及结构已经被深入的研究。IL-34虽然有着与CSF-1相似的激活CSF-1R的效应，但是激活效应更强，半衰期更短(Eda H et al.Cytokine.2010)。在许多组织都能分泌IL-34，但以脾脏的分泌为主导(Clavel G et al.Joint Bone Spine.2013)。IL-34能促进单核细胞的存活，增殖以及分化成巨噬细胞。IL-34也能促进破骨细胞生成。有研究表明，类风湿性关节炎患者关节液中的IL-34水平相比一般的关节炎患者有提升，同时IL-34在滑膜以及关节液中的表达水平与炎症的严重程度成正相关(Baud’huin M et al.J Pathol 2010；Hwang S-J et al.ArthritisRes Ther 2012)。虽然IL-34有着与CSF-1相似的激活CSF-1R的能力，但研究指出它们的功能是不重叠的，它们的表达方式存在时空差异(Wei，S.et al.J.Leukoc.Biol.2010)。Tetsuya Mizuno报道IL-34能够选择性的增强小鼠小胶质细胞对于神经毒性的修复能力(T Mizuno.et al.Am J Pathol.2011)。同时有研究通过IL-34LacZ/LacZ小鼠模型，发现IL-34具有组织限定性(Wang，Y.et al.Nat Immunol.2012)。该研究发现IL-34主要由皮肤和中枢神经系统分泌，在IL-34缺失时，上皮的朗格汉斯细胞发育受到影响而使小鼠出现接触过敏症状，而缺少IL-34的小神经胶质细胞会在数量上受到影响，削弱小胶质细胞对于中枢神经系统的保护能力。这个研究展示出IL-34在神经保护和修复方面具有成药潜力。IL-34在神经元修复中展现的有意义影响使得IL-34具有了成药可能性(Wang，Y.et al.Nat Immunol.2012)。对于蛋白类药物，保质期以及在体内的半衰期是能否成药的重要条件，这些条件都与蛋白的热稳定性有关系。一个新的细胞因子如果要成为上市药物，必须要提升蛋白的稳定性，但是自发现以来尚无提升IL-34热稳定性的方法。
技术实现思路
针对现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种提高IL-34热稳定性的方法，所述方法通过对IL-34进行氨基酸定点突变来提高IL-34的热稳定性，在提高IL-34热稳定性的同时，保持了IL-34的生物活性，让IL-34具有更大的成药潜力。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的。一种提高IL-34热稳定性的方法，所述方法通过对IL-34进行氨基酸定点突变，将IL-34的98号丝氨酸突变成半胱氨酸来提高IL-34的热稳定性，下文中，用S98C IL-34指代98号丝氨酸残基突变成半胱氨酸的IL-34，所述S98C IL-34单体的氨基酸序列如下：所述方法具体步骤如下：将GeneBank ID：NM_152456的表达蛋白质的IL-34 cDNA中表达98号丝氨酸的密码子agc，采用基因定点突变为表达半胱氨酸的密码子tgt；将突变后的S98C IL-34 cDNA与BacVector-3000杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞来制取表达S98C IL-34的杆状病毒；再使用杆状病毒感染HEK 293细胞表达S98C IL-34。有益效果1.本专利技术提供了一种提高IL-34热稳定性的方法，所述方法基于已有的IL-34结构(PDB ID：4DKC)分析，发现在蛋白核心处98号丝氨酸残基与168号半胱氨酸残基距离很近，两者Cα的距离为为了提升IL-34的热稳定性，将IL-34的98号丝氨酸残基突变成半胱氨酸，下文用native IL-34指代未突变的IL-34，S98C IL-34指代98号丝氨酸残基突变成半胱氨酸的IL-34；2.本专利技术提供了一种提高IL-34热稳定性的方法，所述方法通过蛋白晶体技术结晶S98C IL-34蛋白并解析其结构，从晶体结构层面证实S98C IL-34突变成功，并证实在98号半胱氨酸与168号半胱氨酸之间形成了native IL-34不具备的二硫键；3.本专利技术提供了一种提高IL-34热稳定性的方法，所述方法获得的S98C IL-34与native IL-34相比，Tm(melting temperature)提升了7.6℃，说明S98C IL-34相比native IL-34热稳定性得到了提升。同时经过M-NFS-60细胞的增殖实验和CSF-1R的磷酸化实验，证明S98C IL-34的生物学活性与native IL-34没有显著差别。附图说明图1为PCR程序设置示意图。图2为Native IL-34和S98C IL-34的SDS-PAGE鉴定图。图3为Native IL-34和S98C IL-34经分子筛系统纯化图。图4为条件优化后得到的S98C IL-34晶体。图5为S98C IL-34晶体结构(左)与native IL-34晶体结构图(右)。图6为S98C IL-34晶体结构的单体中Cys98-Cys168二硫键的Fo-Fc差值电子密度图(左：A链；右：B链；Fo-Fc level＝3.0)。图7为native IL-34在不同温度下的同步辐射CD图谱。图8为S98C IL-34在不同温度下的同步辐射CD图谱。图9为Native IL-34和S98C IL-34的二态转化平衡拟合图。图10为S98C IL-34和native IL-34刺激M-NFS-60细胞增殖的浓度依赖曲线图。图11为S98C IL-34和native IL-34激活产生磷酸化的CSF-1R(pCSF-1R)与细胞内总体CSF-1R(Total CSF-1R)的Western blot条带图。图12为S98C IL-34和native IL-34激活产生磷酸化的CSF-1R(pCSF-1R)与细胞内总体CSF-1R(Total CSF-1R)的Western blot条带的灰度比值柱状图。图13为不同种属的IL-34的氨基酸序列比对图(参考Uniprot数据库，用单字母表示氨基酸)。具体实施方式实施例11.表达质粒的构建材料：IL-34的cDNA购自Origene公司。所使用的克隆载体为BacMam载体。实验所用的大肠杆菌菌种为DH5α菌株，购自鼎国生物公司。PCR引物由北京三博远志公司合成。PCR相关试剂：Vent DNA聚合酶(NEB)，dNTP mixture本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高白细胞介素IL‑34热稳定性的方法，其特征在于：所述方法通过对人源IL‑34进行氨基酸定点突变，将人源IL‑34的98号丝氨酸突变成半胱氨酸，即S98C IL‑34。S98C IL‑34的氨基酸序列如下：
【技术特征摘要】
1.一种提高白细胞介素IL-34热稳定性的方法，其特征在于：所述方法通过对人源IL-34进行氨基酸定点突变，将人源IL-34的98号丝氨酸突变成半胱氨酸，即S98C IL-34。S98C IL-34的氨基酸序列如下：2.一种提高白细胞介素IL-34热稳定性的方法，其特征在于：所述方法通过杆状病毒-哺乳动物细胞表达系统制备IL-34突变体。在本发明中，将GeneBank ID：NM_152456的表达蛋白质的IL-34 cDNA中编码98号丝氨酸的密码子agc，采用基因定点突变为...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘合力，黄国龙，丁焕弟，李硕，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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