一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒及检测方法，属于分子遗传学技术领域。该检测方法以鸡全基因组DNA为模板，设计引物扩增miRNA-1606前体在内的目的片段，纯化测序后获知鸡miRNA-1606基因第35位存在C或A的碱基多态性；再设计特定引物扩增含多态性位点的基因片段，并采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术结合单引物延伸反应，对大量样本进行单个SNP位点的检测。该检测方法具有准确可靠、通量灵敏、检测时间短、性价比高等特点，可用于鸡的辅助选择和分子育种，对提高鸡的生长性状具有重要的作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术具体涉及一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒及检测方法，属于分子遗传学

技术介绍
在畜禽的遗传育种中，应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加畜禽生产性能先进的有效的方法。应用分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测与畜禽经济性状密切相关的遗传标记，其次是建立其基因多态性的快速检测方法，然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。鸡作为一种重要的经济禽类，同时也是科研上的一种重要的模式生物，生长性状是评价鸡生产性能的主要指标，是重要的经济性状之一。国内优质地方鸡普遍存在生长速度缓慢的问题，从而影响了经济效益。鸡生长性状是由微效多基因控制的数量性状，由一系列主效基因或数量性状位点决定，多年来，鸡育种工作者通过大量试验研究，力求寻找与鸡生长性状相关的候选基因。单核苷酸多态（Single nucleotide polymorphism，SNP）多样性与经济性状的关联分析一直是畜禽遗传学研究的热点。SNP是指在基因组水平上由于单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。miRNA不仅参与了动物复杂性状表型形成的分子调控过程，而且其SNP变化还可能导致miRNA的功能异常，从而引起生物表型性状的变异。miRNA多态性的形成包括插入、缺失、易位、扩增以及碱基替换。研究发现，发生在miRNA初级产物、前体及成熟体上的多态性会潜在的影响miRNA的功能，导致动物的表型性状发生变化。SNP的多态性与经济性状的相关性分析可为家禽分子选种育种方面提供辅助标记选择。SNPs的检测方法主要包括直接测序、PCR-SSCP、PCR-RFLP、基因芯片技术（GenechiPs）和MassARRAY分子量阵列技术。但直接测序技术成本较高，SSCP操作繁琐、耗时长，且实验过程中存在假阴性问题。普通的PCR-RFLP方法要求待测多态性位点是某一特定酶切位点，应用范围局限。基因芯片造价高昂，所需设备贵重，不利于普及应用。MassARRAY分子量阵列技术直接对分子量进行检测，不涉及荧光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机器本身出错的概率非常低，无需再次验证，也无需设计统计学重复，可以适用于对几个到几百个SNP位点的检测，且利用质谱检测在40min内就可以完成对380个样本的检测，并且实时显示检测结果。每天可以完成几千份样本的检测。引物不带荧光标记，国内即可完成普通引物合成。SNPs具有密度高、分布不均、遗传稳定性强、易于自动化分析等特点。随着科技的进步和仪器设备的更新，SNPs的检测方法呈现出自动化、高通量化的趋势。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒。同时，本专利技术还提供一种鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法。为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，主要包括引物对P2（PCR扩增引物）和引物P3（单碱基延伸引物），引物对P2为：F Primer：5’-ACGTTGGATGAACAAGCAGCGTGAATGGTC-3’（见SEQ ID NO:1），R Primer：5’-ACGTTGGATGTTCAGGACTGTTCTGTTGCC-3’（见SEQ ID NO:2）；引物P3为：5’-GTTGCCCCCTCTTTCAGT-3’（见SEQ ID NO:3）。一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，还可以包括dNTP mix、Hotstar Taq、iPLEX单碱基延伸酶、缓冲液（如10×PCR buffer）、MgCl2、超纯水及iPLEX终止反应Mix等组分，上述组分的浓度和量均可调，便于多次操作使用。具体的，鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，包括500nM引物对P2480μL、500nM单碱基延伸引物P3480μL、25mM dNTP mix48μL、5U/μL Hotstar Taq48μL、iPLEX单碱基延伸酶19.68μL、10×PCR buffer300μL、25mM MgCl2156μL、超纯水888μL、iPLEX终止反应Mix96μL。更具体的，还包括：1U/μL SAP酶240μL、10×SAP buffer81.6μL。一种鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，包括以下步骤：（1）PCR扩增：以鸡全基因组DNA（包含miRNA-1606前体序列/pre-mir-1606）为模板，利用引物对P2进行PCR扩增；（2）SAP纯化：PCR扩增后，利用碱性磷酸酶消化反应剩余的dNTPs；（3）单碱基延伸：消化处理后，利用引物P3进行单碱基延伸反应；（4）样本分析：取步骤（3）处理的样本，利用MALDI-TOF技术进行质谱分析；引物对P2为：F Primer：5’-ACGTTGGATGAACAAGCAGCGTGAATGGTC-3’，R Primer：5’-ACGTTGGATGTTCAGGACTGTTCTGTTGCC-3’；引物P3为：5’-GTTGCCCCCTCTTTCAGT-3’。所述步骤（1）中PCR扩增的反应体系为：超纯水1.85μL、10×PCR buffer0.625μL、25mM MgCl20.325μL、25mM dNTP mix0.1μL、5U/μL Hotstar Taq0.1μL、500nM Primermix(F Primer/R Primer)1μL、10ng/μL鸡全基因组DNA1μL，总体积5μL。所述步骤（1）中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，56℃30s，72℃退火60s，72℃延伸5min，45个循环；4℃保存。所述步骤（2）中消化反应为：在PCR扩增产物中加入1U/μL SAP酶0.5μL、10×SAPbuffer0.17μL和超纯水1.33μL。反应程序为：37℃，40min；85℃，5min；4℃保存。所述步骤（3）中单碱基延伸反应为：在消化产物中加入超纯水0.755μL、10×PCR buffer0.2μL、反应浓度为1×iPLEX终止反应Mix0.2μL、7μM/14μM单碱基延伸引物0.804μL和反应浓度为1×iPLEX单碱基延伸酶0.041μL。反应程序为：94℃30s；40个循环：94℃5s，52℃5s和80℃5s×5个内部循环；72℃3min；最后4℃保存。所述步骤（1）PCR扩增前，还包括miRNA-1606基因突变位点的检测步骤：以鸡全基因组DNA（包含miRNA-1606本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡miRNA‑1606基因多态性检测试剂盒，其特征在于：主要包括引物对P2和引物P3，引物对P2为：F Primer：5’‑ACGTTGGATGAACAAGCAGCGTGAATGGTC‑3’，R Primer：5’‑ACGTTGGATGTTCAGGACTGTTCTGTTGCC‑3’；引物P3为：5’‑GTTGCCCCCTCTTTCAGT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，其特征在于：主要包括引物对P2和
引物P3，
引物对P2为：
F Primer：5’-ACGTTGGATGAACAAGCAGCGTGAATGGTC-3’，
R Primer：5’-ACGTTGGATGTTCAGGACTGTTCTGTTGCC-3’；
引物P3为：5’-GTTGCCCCCTCTTTCAGT-3’。
2.根据权利要求1所述的鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，其特征在于：还
包括dNTP mix、Hotstar Taq、iPLEX单碱基延伸酶、缓冲液、MgCl2及iPLEX终止反应
Mix。
3.根据权利要求2所述的鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，其特征在于：包
括500nM引物对P2480μL、500nM单碱基延伸引物P3480μL、25mM dNTP mix48μL、5U/μL 
Hotstar Taq48μL、iPLEX单碱基延伸酶19.68μL、10×PCR buffer300μL、25mM MgCl2156μL、超纯水888μL、iPLEX终止反应Mix96μL、1U/μL SAP酶240μL、10×SAP buffer
81.6μL。
4.一种鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）PCR扩增：以鸡全基因组DNA为模板，利用引物对P2进行PCR扩增；
（2）SAP纯化：PCR扩增后，利用碱性磷酸酶消化反应剩余的dNTPs；
（3）单碱基延伸：消化处理后，利用引物P3进行单碱基延伸反应；
（4）样本分析：取步骤（3）处理的样本，利用MALDI-TOF技术进行质谱分析；
引物对P2为：
F Primer：5’-ACGTTGGATGAACAAGCAGCGTGAATGGTC-3’，
R Primer：5’-ACGTTGGATGTTCAGGACTGTTCTGTTGCC-3’；
引物P3为：5’-GTTGCCCCCTCTTTCAGT-3’。
5.根据权利要求4所述的鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，其特征在于：所
述步骤（1）中PCR扩增的反应体系为：超纯水1.85μL、10×PCR buffer0.625μL、25mM MgCl20.325μL、25mM dNTP0.1μL、5U/μL Hotstar Taq0.1μL、5...

【专利技术属性】
技术研发人员：康相涛，李红，孙桂荣，刘小军，蒋瑞瑞，田亚东，李国喜，韩瑞丽，闫峰宾，王彦彬，李转见，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41