【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，特别涉及一种同时检测多种儿童成长常见风险基因的试剂盒。
技术介绍
1、儿童成长过程中往往面临较多的健康风险，比如缺铁性贫血、小儿缺锌、过敏性哮喘及过敏性鼻炎等。这些儿童健康风险因素会因不同个体存在差异，也会受到基因等多因素的影响，即与特定的基因位点多态性(single nucleotidepolymorphism，snp)密切相关。
2、有分子遗传学研究显示，关于儿童缺铁性贫血风险，tmprss6基因编码的膜结合丝氨酸蛋白酶影响激素铁调素的表达和分泌，铁调素是调控小肠上皮细胞铁泵蛋白fpn1(俗称铁泵)吸收铁离子的关键分子，当铁调素水平上升时，血清铁水平就会下降，引起缺铁性贫血，反之，则血清铁水平上升。研究表明，tmprss6基因中的rs855791(a)是铁水平下降的风险等位基因，也是铁缺乏和ida基因层面的危险因素。tf基因编码转铁蛋白，参与机体内铁离子的运输和代谢。研究发现rs3811647位点携带aa基因型的女性血清转铁蛋白含量显著高于携带ag/gg基因型的女性。
3、关于小儿缺锌风险，slc30a8基因编码锌转蛋白8(znt8)，主要在胰岛β细胞中表达，负责把锌元素从细胞质转运到细胞囊泡中，在胰岛细胞中，znt8蛋白主要存在胰岛素分泌颗粒中，对胰岛素的结晶、储存和分泌都起着至关重要的作用。slc30a8基因rs13266634位点的突变能够影响slc30a8基因的表达，拥有cc基因型的人其slc30a8基因表达低于拥有tt或者ct基因型的人群。il6编码促炎性细胞因子，能
4、tlr2基因和ifng基因是与过敏性哮喘发病风险相关性最为显著的基因之一。tlr2基因是toll样受体(toll-like receptors,tlr)蛋白基因家族重要成员之一，tlr2能够识别多种病原微生物及其产物，介导天然免疫，通过细胞内信号转导，启动获得性免疫。研究发现与过敏性哮喘有显著相关的tlr2基因rs3804100位点t等位基因与过敏性哮喘的发病风险存在相关性。ifng基因是干扰素γ的编码基因。干扰素是机体免疫系统中重要的细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学功能。通过gwas研究发现，ifng基因rs2069727位点多态性(t/c)与儿童过敏性哮喘发病风险有明显的相关性。这种相关性可能与ifng基因表达水平的差异有关，这种差异会影响机体的免疫应答反应，从而增加过敏性哮喘的发病风险。
5、关于过敏性鼻炎风险，foxp3是叉状头转录因子家族中的一员，有研究者认为其是调节t细胞的标志性分子，foxp3基因rs2232365突变能引起严重的自身免疫性疫病，因此foxp3在调节机体免疫自稳中起关键作用。通过全基因组关联性研究(gwas)研究发现，rs6898653和rs6586513位点突变与过敏性鼻炎有明显的相关性。rs6898653位点g等位基因和rs6586513位点c等位基因为风险基因，这些基因型的存在增加过敏性鼻炎的患病风险。
6、目前常见的snp检测方法主要有：sanger测序、二代测序、pcr、质谱分析法、snapshot法、基因芯片法、高分辨率熔解曲法等。用于检测snp的方法，除了测序法可直接获取核酸信息外，其它方法均是基于已知snp位点进行设计的检测方法。如pcr法中taqman探针法和分子信标法均是基于探针的特异性识别来区分检测snp位点的，但需设计筛选引物和探针并且单位点需要2条特异性mgb探针，成本高；snapshot法和质谱法则均使用了单碱基延伸技术，但是试剂成本高；高分辨率熔解曲法虽然精确，但试剂成本较高及对操作人员技术要求较高。因此开发建立一种同时满足操作简便、一次检测位点多、时间短、成本低等特点的检测方法是目前需要解决的技术问题。
技术实现思路
1、本专利技术目的在于提供一种同时检测多种儿童成长常见风险基因的试剂盒，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。
2、本专利技术第一方面提供了一种同时检测多种儿童成长常见风险基因的试剂盒。所述试剂盒含有用于检测以下若干个snp分子标记的复合扩增体系：tmprss6基因的rs855791位点、tf基因的rs3811647位点、il6基因的rs1800795位点、slc30a8基因的rs13266634位点、tlr2基因的rs3804100位点、ifng基因的rs2069727位点、foxp3基因的rs2232365位点、trnan2基因的rs6586513位点和基因间区中的rs6898653位点。
3、本专利技术提供的试剂盒采用多重荧光标记等位基因分型技术进行复合扩增，一次反应能够同时对缺铁性贫血、锌营养需求、过敏性哮喘、过敏性鼻炎等9个相关风险基因的snp位点进行检测。具有检测效率高，速度快、成本低的优点，且适合大规模样品的检测，为儿童营养与过敏风险基因的快速检测提供一种新的方法。
4、在本专利技术的一些应用实施方式中，所述复合扩增体系针对每个snp位点均设计了两条上游引物和一条公共下游引物。
5、在本专利技术的一些应用实施方式中，各引物组合分为2个群组，第一群组包括扩增所述rs855791位点、所述rs3811647位点、所述rs1800795位点和所述rs13266634位点的引物组合，第二群组包括扩增所述rs3804100位点、所述rs2069727位点、所述rs2232365位点、所述rs6586513位点和所述rs6898653位点的引物组合，各所述引物组合中均具有至少一条标记有荧光染料的引物，同一群组使用相同的荧光染料标记，2个群组的荧光染料标记互不相同。通过两种不同的荧光染料标记将长度相似的扩增产物良好区分开来，使得复合扩增体系中能够共存更多种扩增产物的。
6、在本专利技术的一些应用实施方式中，所述荧光染料选自fam、hex、tamra、sum或vig。优选地，所述第一群组的荧光染料为fam；所述第二组群组的荧光染料为hex。
7、在本专利技术的一些应用实施方式中，为避免混合有多种引物的复合扩增体系能够顺利扩增得到目标产物，可以通过调整引物浓度起到一定的控制作用。
8、在本专利技术的一些应用实施方式中，所述复合扩增体系还包括含dna聚合酶的pcrreaction mix和sdh2o。
9、在本专利技术的一些应用实施方式中，扩增程序为：95℃预变性，持续2分钟；94℃变性，持续30秒，60℃退火，持续1分钟，72℃延伸，持续1分钟，共30个循环；72℃延伸，持续10分钟；16℃维持。
10、本专利技术第二方面提供了上述试剂盒在进行儿童体质风险评估析中的应用。
11、所述应用包括以下步骤：
12、1)提取dna样品；
13、2)使用分光光度计对所述dna样品进本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时检测多种儿童成长常见风险基因的试剂盒，其特征在于，含有用于检测以下若干个SNP分子标记的复合扩增体系：TMPRSS6基因的rs855791位点、TF基因的rs3811647位点、SLC30A8基因的rs13266634位点、IL6基因的rs1800795位点、TLR2基因的rs3804100位点、IFNG基因的rs2069727位点、FOXP3基因的rs2232365位点、TRNAN2基因的rs6586513位点或基因间区中的rs6898653位点。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述复合扩增体系包括扩增所述rs855791位点的引物组合的核苷酸序列如SEQ ID No.1～3所示，扩增所述rs3811647位点的引物组合的核苷酸序列如SEQ ID No.4～6所示，扩增所述rs1800795位点的引物组合的核苷酸序列如SEQ ID No.7～9所示，扩增所述rs13266634位点的引物组合的核苷酸序列如SEQ IDNo.10～12所示，扩增所述rs3804100位点的引物组合的核苷酸序列如SEQ ID No.13～15所示，扩增所述rs20
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，各引物组合分为2个群组，第一群组包括扩增所述rs855791位点、所述rs3811647位点、所述rs13266634位点和所述rs1800795位点的引物组合，第二群组包括扩增所述rs3804100位点、所述rs2069727位点、所述rs2232365位点、所述rs6586513位点和所述rs6898653位点的引物组合，各所述引物组合中均具有至少一条标记有荧光染料的引物，同一群组使用相同的荧光染料标记，2个群组的荧光染料标记互不相同。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述荧光染料选自FAM、HEX、TAMRA、SUM或VIG。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述第一群组的荧光染料为FAM；所述第二组群组的荧光染料为HEX。
6.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的引物的浓度为0.05μM，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的引物的浓度为0.05μM，核苷酸序列如SEQID No.3所示的引物的浓度为0.10μM，核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示的引物的浓度为0.07μM，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的引物的浓度为0.04μM，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的引物的浓度为0.11μM，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的引物的浓度为0.06μM，核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的引物的浓度为0.05μM，核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的引物的浓度为0.10μM，核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的引物的浓度为0.05μM，核苷酸序列如SEQID No.11所示的引物的浓度为0.05μM，核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的引物的浓度为0.10μM，核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的引物的浓度为0.07μM，核苷酸序列如SEQ IDNo.14所示的引物的浓度为0.05μM，核苷酸序列如SEQ ID No.15所示的引物的浓度为0.12μM，核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的引物的浓度为0.08μM，核苷酸序列如SEQ ID No.17所示的引物的浓度为0.04μM，核苷酸序列如SEQ ID No.18所示的引物的浓度为0.11μM，核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的引物的浓度为0.05μM，核苷酸序列如SEQ ID No.20所示的引物的浓度为0.04μM，核苷酸序列如SEQ ID No.21所示的引物的浓度为0.10μM，核苷酸序列如SEQ ID No.22所示的引物的浓度为0.05μM，核苷酸序列如SEQ ID No.23所示的引物的浓度为0.05μM，核苷酸序列如SEQ ID No.24所示的引物的浓度为0.10μM，核苷酸序列如SEQID No.25所示的引物的浓度为0.06μM，核苷酸序列如SEQ ID No.26所示的引物的浓度为0.06μM，核苷酸序列如SEQ ID No.27所示的引物的浓度为0.12μM。
7.根据权利要求1至6任一项所述试剂盒，...
【技术特征摘要】
1.一种同时检测多种儿童成长常见风险基因的试剂盒，其特征在于，含有用于检测以下若干个snp分子标记的复合扩增体系：tmprss6基因的rs855791位点、tf基因的rs3811647位点、slc30a8基因的rs13266634位点、il6基因的rs1800795位点、tlr2基因的rs3804100位点、ifng基因的rs2069727位点、foxp3基因的rs2232365位点、trnan2基因的rs6586513位点或基因间区中的rs6898653位点。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述复合扩增体系包括扩增所述rs855791位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.1～3所示，扩增所述rs3811647位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.4～6所示，扩增所述rs1800795位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.7～9所示，扩增所述rs13266634位点的引物组合的核苷酸序列如seq idno.10～12所示，扩增所述rs3804100位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.13～15所示，扩增所述rs2069727位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.16～18所示，扩增所述rs2232365位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.19～21所示，扩增所述rs6586513位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.22～24所示，扩增所述rs6898653位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.25～27所示。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，各引物组合分为2个群组，第一群组包括扩增所述rs855791位点、所述rs3811647位点、所述rs13266634位点和所述rs1800795位点的引物组合，第二群组包括扩增所述rs3804100位点、所述rs2069727位点、所述rs2232365位点、所述rs6586513位点和所述rs6898653位点的引物组合，各所述引物组合中均具有至少一条标记有荧光染料的引物，同一群组使用相同的荧光染料标记，2个群组的荧光染料标记互不相同。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述荧光染料选自fam、hex、tamra、sum或vig。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述第一群组的荧光染料为fam；所述第二组群组的荧光染料为hex。
6.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.1所示的引物的浓度为0.05μm，核苷酸序列如seq i...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓诗莹，吴伟斌，杜蔚安，郑阳阳，林小清，
申请(专利权)人：广东华美众源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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