【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸纯化，尤其是涉及质粒dna纯化方法及试剂盒。
技术介绍
1、细胞及基因治疗的快速发展为人类疑难顽固疾病的防治带来了希望，其中以表达目的基因的重组质粒为基础的非病毒转移策略具有安全性好等突出优点，更加受到研究者的青睐。质粒dna既可以作为在mrna疫苗或者重组病毒载体疫苗的原料，也可以作为核酸药物单独使用，因此对质粒dna在质量与需求量日益升高下，质粒dna的生产工艺面临着新的挑战，因此我们急需开发一种高效制备质粒dna样品的纯化工艺，并且可进行工业化放大。
2、目前质粒dna的纯化方法最常用的是cytiva经典的三步层析法：包括凝胶过滤层析主要去除裂解中和后的rna杂质；亲和层析超螺旋质粒选择性吸附、以及离子交换层析内毒素和其他杂质去除。该纯化工艺第一步所用的凝胶过滤层析中上样体积受到柱体积和料液粘度影响，上样体积最多为柱体积的30％；同时凝胶过滤层析在操作使用过程中普遍存在流速低，易塌陷的现象，生产过程耗时对较长、层析柱重装频率相对较高，这在某种程度上限制了质粒dna大规模工艺化的生产需求。
3、此外，下游生产工艺也可开发两步法用于质粒dna的纯化。两步层析法主要是基于cacl2或(nh4)2so4沉淀法的前处理，去除大部份rna和宿主蛋白，使得后续只需要疏水层析去除开环dna和离子交换层析去除内毒素、宿主蛋白及宿主核酸的两步法工艺。然而氯化钙沉淀杂质的同时也会大量沉淀质粒dna造成回收率低，质粒损失，且沉淀法操作繁琐，相对开放，自动化程度和平台化程度不高，而硫酸铵用量较大，对操作人员
4、这两种最常用的分离质粒dna的方法应用于大规模生产质粒dna上均有局限性和限制性，为解决现有技术的不足，我们需要开发创新的质粒制备方法，尤其是更简化并可行的纯化工艺，实现更高效大规模质粒dna的制备。因此本专利技术旨在提供一种使用一步层析步骤的分离方法，其使得在更短的时间内分离大量的质粒dna成为可能，并且产品符合美国食物和药品管理局(fda)的质量标准。
5、鉴于这些限制，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种质粒dna纯化方法及对应使用的纯化试剂盒，以期通过该方法能够获得具有更高纯度和高收率的质粒dna，并且能够大规模推广生产。
2、为了解决上述技术问题，实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了质粒dna纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：
4、s1：采用碱裂解法对含有质粒dna的细菌进行裂解，得到裂解液；
5、s2：在s1获得的裂解液中加入含有乙酸钾和乙酸铵的中和液，得到中和混合液；
6、s3：将s2获得的中和混合液用滤袋过滤进行固液分离，得到分离液；
7、s4：将s3获得的分离液经过中空纤维超滤，得到浓缩液；
8、s5：将s4获得的浓缩液上样到阴离子交换层析柱上进行冲洗和洗脱，收集含质粒的洗脱液；
9、s6：将上述洗脱液进行超滤浓缩和换液，并经过除菌过滤，得到目的质粒dna原液。
10、在可选实施方式中，在s2中，所述乙酸钾的浓度为1～2m；所述乙酸铵的浓度为3～7m；优选地，所述乙酸铵的浓度为6～7m。
11、在可选实施方式中，在s3中，所述滤袋选自尼龙材质或pp材质；所述滤袋的孔径为50μm～400μm，所述滤袋的面积为0.3m2～0.5m2。
12、优选地，所述滤袋选自pp材质；所述滤袋的孔径为50μm～200μm。
13、更优选地，所述滤袋的孔径为100μm。
14、在可选实施方式中，在s4中，所述中空纤维的膜面积为1.25m2，截留孔径为100kd～800kd；所述中空纤维过滤样品时的进样流速为200～600lmh。
15、优选地，所述中空纤维的截留孔径为100kd～500kd。
16、在可选实施方式中，在s5中，所述阴离子交换层析柱的填料选自nanogel 50q。
17、优选地，nanogel 50q的填充量为每1.0～5.0mg质粒dna对应1ml nanogel 50q填料。
18、更优选地，nanogel 50q的填充量为每2.0～4.0mg质粒dna对应1ml nanogel 50q填料。
19、在可选实施方式中，在s5中，平衡阴离子交换层析柱缓冲液中氯化钠的浓度为0.4m～0.5m；冲洗阴离子交换层析柱缓冲液中氯化钠的浓度为0.55m～0.8m；洗脱阴离子交换层析柱缓冲液中氯化钠的浓度为0.85m～1.25m；其中，tris的浓度为10mm，edta的浓度为1mm；优选地，在s5中，上样液电导率为80ms/cm～100ms/cm，保留时间为6～10min。
20、在可选实施方式中，在s6中，可选用中空纤维超滤柱进行超滤浓缩，优选地，超滤浓缩时的进样流速为100～400lmh。
21、优选地，所述除菌过滤包括使用囊式滤器过滤；优选地，所述囊式滤器的孔径为0.22μm。
22、在可选实施方式中，在完成s5步骤后，收集的洗脱液再进一步进行亲和层析或疏水层析，而后再进行s6步骤。
23、优选地，所述亲和层析或疏水层析包含：取s5收集的洗脱液，加入终浓度为2.5m的硫酸铵，过预平衡好的疏水层析，平衡液配方：1×tris-edta，ph7.5，含2.5m硫酸铵；然后含有2.0m硫酸铵1×tris-edta，ph7.5的缓冲液进行第二洗脱，收集第二洗脱液。
24、第二方面，本专利技术提供了质粒dna纯化试剂盒，包括阴离子交换层析缓冲液；所述阴离子交换层析缓冲液为含有氯化钠的tris-edta溶液，所述阴离子交换层析缓冲液包括阴离子交换层析平衡液a1、阴离子交换层析冲洗缓冲液a2和阴离子交换层析洗脱缓冲液a3。
25、优选地，所述阴离子交换层析平衡液a1中氯化钠的浓度为0.4m～0.5m；所述阴离子交换层析冲洗缓冲液a2中氯化钠的浓度为0.55m～0.8m；所述阴离子交换层析洗脱缓冲液a3中氯化钠的浓度为0.85m～1.25m；其中，tris的浓度为10mm，edta的浓度为1mm。
26、优选地，还包括用于阴离子交换层析的填料nanogel 50q；优选地，nanogel 50q的填充量为每1.0～5.0mg质粒dna对应1ml nanogel 50q填料。
27、更优选地，nanogel 50q的填充量为每2.0～4.0mg质粒dna对应1ml nanogel 50q填料。
28、在可选实施方式中，所述质粒dna纯化试剂盒还包括中和液乙酸钾和乙酸铵，所述乙酸钾的浓度为1～2m；所述乙酸铵的浓度为3～7m；更优选地，所述乙酸铵的浓度为6～7m。
29、优选地，所述质粒dna纯化试剂盒还包括滤袋，所述滤袋选自尼龙材质或pp材质；所述滤袋的孔径本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.质粒DNA纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S2中，所述乙酸钾的浓度为1～2M；所述乙酸铵的浓度为3～7M；优选地，所述乙酸铵的浓度为6～7M。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S3中，所述滤袋选自尼龙材质或PP材质；所述滤袋的孔径为50μm～400μm，所述滤袋的面积为0.3m2～0.5m2；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S4中，所述中空纤维的膜面积为1.25m2，截留孔径为100KD～800KD；所述中空纤维过滤样品时的进样流速为200～600LMH；
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S5中，所述阴离子交换层析柱的填料选自NanoGel 50Q；
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S5中，平衡阴离子交换层析柱缓冲液中氯化钠的浓度为0.4M～0.5M；冲洗阴离子交换层析柱缓冲液中氯化钠的浓度为0.55M～0.8M；洗脱阴离子交换层析柱缓冲液中氯化钠的浓度为0.85M～1.25M；其中，Tris的浓度为10m
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在S6中，可选用中空纤维超滤柱进行超滤浓缩，优选地，超滤浓缩时的进样流速为100～400LMH；
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在完成S5步骤后，收集的洗脱液再进一步进行亲和层析或疏水层析，而后再进行S6步骤；
9.质粒DNA纯化试剂盒，其特征在于，包括阴离子交换层析缓冲液；所述阴离子交换层析缓冲液为含有氯化钠的Tris-EDTA溶液，所述阴离子交换层析缓冲液包括阴离子交换层析平衡液A1、阴离子交换层析冲洗缓冲液A2和阴离子交换层析洗脱缓冲液A3；
10.根据权利要求9所述的质粒DNA纯化试剂盒，其特征在于，所述质粒DNA纯化试剂盒还包括中和液乙酸钾和乙酸铵，所述乙酸钾的浓度为1～2M；所述乙酸铵的浓度为3～7M；更优选地，所述乙酸铵的浓度为6～7M；
...【技术特征摘要】
1.质粒dna纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在s2中，所述乙酸钾的浓度为1～2m；所述乙酸铵的浓度为3～7m；优选地，所述乙酸铵的浓度为6～7m。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在s3中，所述滤袋选自尼龙材质或pp材质；所述滤袋的孔径为50μm～400μm，所述滤袋的面积为0.3m2～0.5m2；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在s4中，所述中空纤维的膜面积为1.25m2，截留孔径为100kd～800kd；所述中空纤维过滤样品时的进样流速为200～600lmh；
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在s5中，所述阴离子交换层析柱的填料选自nanogel 50q；
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在s5中，平衡阴离子交换层析柱缓冲液中氯化钠的浓度为0.4m～0.5m；冲洗阴离子交换层析柱缓冲液中氯化钠的浓度为0.55m～0.8m；洗脱阴离子交换层析柱缓冲液中氯化钠的浓度为0...
【专利技术属性】
技术研发人员：居维艳，吴宗圣，
申请(专利权)人：艾棣维欣苏州生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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