【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及阻止单链核酸模板文库的复性的方法。
技术介绍
1、对生物样本中存在的分析物(诸如核酸序列)的检测已被用作鉴定和分类微生物、诊断传染病、检测和表征遗传异常、鉴定与癌症相关联的遗传变化、研究对疾病的遗传易感性，以及测量对各种类型的治疗的反应的方法。用于检测生物样本中的分析物(诸如核酸序列)的常用技术是核酸测序。
2、生物分子研究的进展部分地由用于表征分子或其生物反应的技术的改进引起。特别地，核酸dna和rna研究得益于对用于序列分析的技术的开发。
3、核酸扩增方法是已知的，该方法允许将扩增产物固定在固体载体上，以便形成由簇或“集落”组成的阵列，该簇或“集落”由多个相同的固定化多核苷酸链和多个相同的固定化互补链形成。根据这些方法制备的簇阵列上的dna集落中存在的核酸分子可提供用于测序反应的模板。
4、一种用于对多核苷酸模板进行测序的方法涉及使用dna聚合酶进行多次延伸反应，以将标记的核苷酸连续地掺入模板链中。在此类“合成测序”反应中，通过连续掺入与模板链互补的单独核苷酸在5'至3'方向上构建与模板链碱基配对的新核苷酸链。
技术实现思路
1、在本专利技术的一个方面，提供了一种阻止单链模板文库的复性或使其最小化的方法，所述方法包括使用与单链模板上的衔接子序列的一部分基本上互补的至少一种阻断寡核苷酸，其中所述阻断寡核苷酸在第一温度处与所述衔接子序列杂交，其中所述第一温度是储存所述模板文库的温度；并在第二温度处与所述衔接子序列解离，其中所述第二温
2、在本专利技术的另一方面，提供了一种储存单链模板文库的方法，所述方法包括提供变性的单链模板文库以及使用至少一种阻断寡核苷酸以阻止所述模板文库在储存期间的复性，其中所述阻断寡核苷酸与单链模板上的衔接子序列的一部分基本上互补。
3、在本专利技术的另一个方面，提供了一种将双链模板文库接种到固体基底上的方法，所述方法包括(i)使所述双链模板文库变性以形成单链模板文库；(ii)应用至少一种阻断寡核苷酸以阻止所述单链模板文库的复性；(iii)将所述文库保持在20℃与40℃之间，优选在20℃与35℃之间，更优选在25℃与35℃之间，甚至更优选在30℃与35℃之间，以及通常约或在35℃的温度处，直到需要接种；(iii)将所述温度升高至高于40℃，优选40℃至60℃，更优选在45℃与60℃之间，甚至更优选在50℃与60℃之间，还甚至更优选在50℃与55℃之间，以及通常约或在50℃处，以使所述至少一种阻断寡核苷酸解离以及(iv)使所述单链模板文库与固定到所述固体基底上的扩增引物杂交，其中所述阻断寡核苷酸与单链模板上的衔接子序列的一部分基本上互补。
4、在本专利技术的另一个方面，提供了一种杂交缓冲液，其中所述杂交缓冲液包含中和剂和至少一种阻断寡核苷酸；其中所述阻断寡核苷酸与单链模板文库链上的衔接子序列的至少一部分基本上互补，其中所述阻断寡核苷酸被构造为在第一温度处与所述衔接子序列杂交，其中所述第一温度是储存所述模板文库的温度；并且其中所述阻断寡核苷酸还被构造为在第二温度处与所述衔接子序列解离，其中所述第二温度是模板接种杂交温度。
5、在本专利技术的另一方面，提供了一种包含选自seq id no:5、6和7或其变体的序列的p5'阻断寡核苷酸，其中所述变体与seq id no:5、6和7具有至少80％的序列同一性。
6、在本专利技术的另一方面，提供了一种包含选自seq id no:8、9和10或其变体的序列的p7'阻断寡核苷酸，其中所述变体与seq id no:8、9和10具有至少80％的序列同一性。
7、在本专利技术的另一方面，提供了一种阻断的模板文库，其中所述模板文库包含多个单链模板序列和多个阻断寡核苷酸，其中所述阻断寡核苷酸与衔接子序列的至少一部分，优选衔接子序列的p5'引物结合序列和/或p7'引物结合序列杂交，其中所述p5'引物结合序列的序列包括seq id no:3或其变体并且所述p7'引物结合序列的序列包括seq id no:4或其变体。
8、在本专利技术的另一方面，提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包含选自seq idno:5、6、7、8、9和10或其变体的至少一种核酸，其中所述变体与seq id no:5、6、7、8、9和10具有至少80％的序列同一性，并且其中所述核酸序列可操作地连接至调控序列，优选启动子。
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1.一种阻止单链模板文库的复性或使其最小化的方法，所述方法包括使用与单链模板上的衔接子序列的一部分基本上互补的至少一种阻断寡核苷酸，其中所述阻断寡核苷酸在第一温度处与所述衔接子序列杂交，其中所述第一温度是储存所述模板文库的温度；并在第二温度处与所述衔接子序列解离，其中所述第二温度是模板接种杂交温度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述模板包含含有P5引物结合序列或P7引物结合序列的5'衔接子序列和含有P5'引物结合序列或P7'引物结合序列的3'衔接子序列，并且其中所述至少一种阻断寡核苷酸与选自P5结合序列、P5'结合序列、P7结合序列和P7'结合序列，优选P5'结合序列和P7'结合序列的至少一种引物结合序列的至少一部分基本上互补，其中所述P5引物结合序列的序列包括SEQ ID NO:1或其变体，所述P5'引物结合序列的序列包括SEQ ID NO:3或其变体，所述P7引物结合序列的序列包括SEQ ID NO:2或其变体并且所述P7'引物结合序列的序列包括SEQ ID NO:4或其变体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法包括使用与P5'引物结合序
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述方法包括使用与P5'引物结合序列和/或P7'引物结合序列的至少两个不同部分基本上互补的至少两种阻断寡核苷酸。
5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述模板文库的第一储存温度在20℃与40℃之间，优选在20℃与35℃之间，更优选在25℃与35℃之间，甚至更优选在30℃与35℃之间，最优选约35℃，并且/或者其中第二模板接种杂交温度在40℃与60℃之间，优选在45℃与60℃之间，更优选在50℃与60℃之间，甚至更优选在50℃与55℃之间，最优选约50℃。
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述阻断寡核苷酸具有11与14个核苷酸之间的长度和/或30℃与45℃之间的解链温度(Tm)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述Tm在35℃与43℃之间。
8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述阻断寡核苷酸与所述衔接子序列的杂交形成阻断的模板文库。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中将所述阻断的模板文库的温度升高至高于所述阻断寡核苷酸的所述Tm以形成未阻断的单链模板文库。
10.根据权利要求9所述的方法，其中将所述阻断的文库的温度升高至在40℃与60℃之间，优选在45℃与60℃之间，更优选在50℃与60℃之间，甚至更优选在50℃与55℃之间，最优选约50℃的温度。
11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中除去变性的阻断寡核苷酸，任选地其中所述方法还包括在所述单链模板与流通池杂交后洗掉所述变性的阻断寡核苷酸的步骤。
12.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述模板文库是PCR文库。
13.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述P5'阻断寡核苷酸包含来自SEQ IDNO:5、6或7或其变体的序列，其中所述变体与SEQ ID NO:5、6或7具有至少80％的序列同一性。
14.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述P7'阻断寡核苷酸包含选自SEQ IDNO:8、9或10或其变体的序列，其中所述变体与SEQ ID NO:8、9或10具有至少80％的序列同一性。
15.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述阻断寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述修饰的核苷酸是所述阻断寡核苷酸的3'末端核苷酸，并且所述修饰的核苷酸包含3'磷酸基团。
17.根据任一前述权利要求所述的方法，其中当所述文库保持在所述模板文库的所述第一储存温度时，阻止所述单链模板文库的复性或使其最小化。
18.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述单链模板文库在双链模板文库变性后形成，并且其中所述至少一种阻断寡核苷酸在变性后添加到所述单链模板文库中。
19.一种储存单链模板文库的方法，所述方法包括提供变性的单链模板文库以及使用至少一种阻断寡核苷酸以阻止所述模板文库在储存期间的复性，其中所述阻断寡核苷酸与单链模板上的衔接子序列的一部分基本上互补。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述文库在20℃与40℃之间，优选在20℃与35℃之间，更优选在25℃与35℃之间，甚至更优选在30℃与35℃之间，最优选约35℃的温度处储存至少1小...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种阻止单链模板文库的复性或使其最小化的方法，所述方法包括使用与单链模板上的衔接子序列的一部分基本上互补的至少一种阻断寡核苷酸，其中所述阻断寡核苷酸在第一温度处与所述衔接子序列杂交，其中所述第一温度是储存所述模板文库的温度；并在第二温度处与所述衔接子序列解离，其中所述第二温度是模板接种杂交温度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述模板包含含有p5引物结合序列或p7引物结合序列的5'衔接子序列和含有p5'引物结合序列或p7'引物结合序列的3'衔接子序列，并且其中所述至少一种阻断寡核苷酸与选自p5结合序列、p5'结合序列、p7结合序列和p7'结合序列，优选p5'结合序列和p7'结合序列的至少一种引物结合序列的至少一部分基本上互补，其中所述p5引物结合序列的序列包括seq id no:1或其变体，所述p5'引物结合序列的序列包括seq id no:3或其变体，所述p7引物结合序列的序列包括seq id no:2或其变体并且所述p7'引物结合序列的序列包括seq id no:4或其变体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法包括使用与p5'引物结合序列的至少一部分基本上互补的至少一种阻断寡核苷酸(p5'阻断寡核苷酸)和/或与p7'引物结合序列的至少一部分基本上互补的至少一种阻断寡核苷酸(p7'阻断寡核苷酸)。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述方法包括使用与p5'引物结合序列和/或p7'引物结合序列的至少两个不同部分基本上互补的至少两种阻断寡核苷酸。
5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述模板文库的第一储存温度在20℃与40℃之间，优选在20℃与35℃之间，更优选在25℃与35℃之间，甚至更优选在30℃与35℃之间，最优选约35℃，并且/或者其中第二模板接种杂交温度在40℃与60℃之间，优选在45℃与60℃之间，更优选在50℃与60℃之间，甚至更优选在50℃与55℃之间，最优选约50℃。
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述阻断寡核苷酸具有11与14个核苷酸之间的长度和/或30℃与45℃之间的解链温度(tm)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述tm在35℃与43℃之间。
8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述阻断寡核苷酸与所述衔接子序列的杂交形成阻断的模板文库。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中将所述阻断的模板文库的温度升高至高于所述阻断寡核苷酸的所述tm以形成未阻断的单链模板文库。
10.根据权利要求9所述的方法，其中将所述阻断的文库的温度升高至在40℃与60℃之间，优选在45℃与60℃之间，更优选在50℃与60℃之间，甚至更优选在50℃与55℃之间，最优选约50℃的温度。
11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中除去变性的阻断寡核苷酸，任选地其中所述方法还包括在所述单链模板与流通池杂交后洗掉所述变性的阻断寡核苷酸的步骤。
12.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述模板文库是pcr文库。
13.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述p5'阻断寡核苷酸包含来自seq idno:5、6或7或其变体的序列，其中所述变体与seq id no:5、6或7具有至少80％的序列同一性。
14.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述p7'阻断寡核苷酸包含选自seq idno:8、9或10或其变体的序列，其中所述变体与seq id no:8、9或10具有至少80％的序列同一性。
15.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述阻断寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述修饰的核苷酸是所述阻断寡核苷酸的3'末端核苷酸，并且所述修饰的核苷酸包含3'磷酸基团。
17.根据任一前述权利要求所述的方法，其中当所述文库保持在所述模板文库的所述第一储存温度时，阻止所述单链模板文库的复性或使其最小化。
18.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述单链模板文库在双链模板文库变性后形成，并且其中所述至少一种阻断寡核苷酸在变性后添加到所述单链模板文库中。
19.一种储存单链模板文库的方法，所述方法包括提供变性的单链模板文库以及使用至少一种阻断寡核苷酸以阻止所述模板文库在储存期间的复...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·贝维斯莫特，D·S·布赖恩二世，
申请(专利权)人：因美纳有限公司，
类型：发明
国别省市：
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