【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体上涉及巨噬细胞，尤其涉及(但并非仅仅涉及)gm-csf依赖性的自我更新非转化猪巨噬细胞的建立。
技术介绍
1、巨噬细胞是参与检测、吞噬和破坏细菌及其他有害生物的专门细胞。此外，它们还可以向t细胞呈递抗原，并通过释放激活其他细胞的分子(称为细胞因子)来引发炎症。
2、巨噬细胞在抵御感染方面至关重要，并且对这些细胞的体外研究是理解宿主-病原体相互作用和支持疫苗开发的关键。
3、根据它们的发育和器官分布，巨噬细胞具有非常不同的特性。以前，所有组织驻留巨噬细胞(包括肺泡巨噬细胞(am))都被认为是寿命有限的骨髓造血干细胞(hsc)衍生细胞。然而，最近的研究表明，大多数组织驻留巨噬细胞代表了一个功能不同的独立胚胎巨噬细胞衍生谱系(1)。大多数组织驻留巨噬细胞是巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)驱动的自我更新细胞，而am是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)依赖性的自主生长细胞。am在巨噬细胞中具有独特的特征，包括对病原体的敏感性和反应(2)。
4、因为转化细胞系可能无法准确地代表原代细胞，所以最好利用原代细胞来研究巨噬细胞。巨噬细胞发病机理研究大多采用直接从器官分离的细胞或者采用来自骨髓祖细胞或外周血单个核细胞(pbmc)的体外产生的m-csf衍生巨噬细胞(3)。来自人pbmc的gm-csf衍生巨噬细胞可以用于模拟人肺am(4)。然而，这些方法提供的是寿命有限且可用性有限的细胞，并难以进行遗传操纵，并且显著的供体间变异性限制了它们的使用。
5、因为相对容易获得组织和进行
6、最近，我们建立了一种来自胎儿肝脏的新型非转化持续生长小鼠巨噬细胞模型(mpi细胞)，其提供了无限量的原代细胞。这个强健的系统在体外如实地再现了小鼠对各种呼吸道病原体的am特异性反应(6)。
7、对猪的巨噬细胞研究非常重要(5)。猪极易感染各种病毒(例如，非洲猪瘟病毒[asfv]、猪繁殖与呼吸综合征病毒[prrsv]和甲型流感病毒[iav])和细菌(例如，鸟分枝杆菌和沙门氏菌)病原体，这些病原体会在巨噬细胞内复制和/或极大地改变巨噬细胞的功能(7-9)。这些病原体中的一些病原体从猪传播给人类并在人类中引起严重的疾病(例如，iav)(9)。此外，猪模型越来越多地用于生物医学研究，因为猪和人的生理(比如气道的解剖结构和功能以及疾病易感性)相比小鼠来说彼此更接近(10)。
8、m-csf可以用于从单核细胞分化出猪巨噬细胞，对lps刺激的巨噬细胞的详细分析表明了猪和人mcsf衍生的巨噬细胞之间的密切功能关系(5)。然而，这些mcsf衍生巨噬细胞需要从骨髓中新鲜分化出来，并且与小鼠和人类细胞类似，它们的寿命是有限的，这使得它们不适合生产病毒疫苗，并且没有合适的强健原代非转化传代猪巨噬细胞系可以用于研究和疫苗生产。
9、重要病原体(比如iav、asfv和prrsv)的研究需要这类巨噬细胞系。
10、人类和猪是iav的自然宿主，并且疾病可以在这两个物种之间双向传播(9)。iav是导致人类死亡的主要传染病。am和先天免疫反应在iav感染的发病机理中起着关键作用(11)。猪容易感染多种iav病毒株，并被认为是这些病原体的混合容器，因为禽和人iav病毒株都在猪体内复制，并且共感染可能会导致新的病毒(比如导致最近2009年疫情的三元(禽-人-猪)重组h1n1病毒株)。
11、asfv和prrsv是具有巨大经济意义的病原体。这些病毒几乎只在巨噬细胞中复制，因此为了对它们进行有效的研究和疫苗开发，需要建立一个持续增长的容许性巨噬细胞系统(7，8)。asfv病毒会在猪体内引起一种类似埃博拉病的破坏性出血综合征。它几乎杀死了所有受感染的动物，并且在2018年和2019年导致近150万头猪和1万头野猪死亡。疫苗的缺乏限制了疾病控制，并且研究旨在更好地了解病毒如何与巨噬细胞相互作用并调节其功能。这很重要，因为缺失抗干扰素病毒基因的潜在疫苗株会引起强烈的先天反应，这种先天反应限制了病毒生长并阻止了在正常巨噬细胞中有效产生疫苗(7)。
12、prrsv是最具经济意义的猪病原体之一，其在大多数猪肉生产国家流行，并且肺am是该病毒的主要自然感染目标(8)。有两种不同的prrsv种类正在迅速地多样化，并且新出现的高致病性毒株传播速度很快且造成了毁灭性的影响。疫苗接种是控制该疾病的关键。然而，现有疫苗的保护能力不足，因此亟需开发出更安全且免疫原性更强的疫苗，而合适的体外系统对此至关重要。
技术实现思路
1、本专利技术涉及一种gm-csf衍生的连续的非转化猪巨噬细胞系统的建立。
2、一种用于生产连续复制的非转化猪巨噬细胞的方法包括：在添加了gm-csf的培养基中培养来自猪器官的细胞制剂，从而将细胞群体分化成自我更新的非转化巨噬细胞。
3、本专利技术的一个方面提供了一种用于生产连续复制的非转化猪巨噬细胞的方法，包括：在添加了gm-csf的培养基中培养来自猪器官的细胞制剂，从而将细胞群体分化成自我更新的非转化巨噬细胞。
4、细胞制剂可以与饲养细胞(比如间充质饲养细胞)一起培养。
5、采用该方法制备的巨噬细胞的特征可以在于猪巨噬细胞标志物cd163、cd172a的表达。
6、细胞制剂可以基于猪胎儿脾细胞。
7、本专利技术还提供了通过本文所述和/或定义的方法获得或可获得的巨噬细胞。
8、本专利技术还提供了可以通过本文所述的方法获得的巨噬细胞，用于药物和/或医学/药学研究。
9、本专利技术还提供了可以通过本文所述的方法获得的巨噬细胞，用于疫苗生产。
10、本专利技术还提供了gm-csf衍生的连续复制的非转化猪巨噬细胞系。
11、该巨噬细胞的特征可以在于猪巨噬细胞标志物cd163、cd172a的表达。
12、本专利技术还提供了一种连续复制的非转化猪巨噬细胞系统。
13、该系统的特征可以在于猪巨噬细胞标志物cd163、cd172a的表达。
14、本专利技术的一些方面和实施方式基于通过利用gm-csf和合适的间充质饲养细胞可以从猪造血器官获得连续复制的非转化巨噬细胞的原理或观察。
15、获得了以下与该系统相关的数据：
16、1.我们用gm-csf(20μg/ml)来培养猪胎儿脾细胞，以分化出巨噬细胞。在定期更换培养基和补充gm-csf之后，含有两种不同细胞类型的培养物逐渐形成。在扁平的间充质或成纤维细胞样细胞上，松散附着的圆形巨噬细胞样细胞成团生长，并且这些巨噬细胞样细胞中的一些巨噬细胞样细胞也漂浮在培养基中。因为在没有gm-csf的情况下脾细胞培养物不会产生活细胞，所以两种细胞的发育都需要gm-csf。通过定期更换培养基，这些培养物可以保本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于生产连续复制的非转化猪巨噬细胞的方法，包括：在添加了GM-CSF的培养基中培养来自猪器官的细胞制剂，从而将所述细胞群体分化成自我更新的非转化巨噬细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中利用饲养细胞来培养所述细胞制剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述饲养细胞包括间充质饲养细胞。
4.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中巨噬细胞的特征在于猪巨噬细胞标志物CD163、CD172a的表达。
5.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中巨噬细胞的特征在于Integrin alphaM(CD11b)和/或MHC II类细胞表面受体(HLA-DR)的表达。
6.根据上述权利要求中任一项所述的方法，基于猪胎儿脾细胞。
7.巨噬细胞，可以通过上述权利要求中任一项所述的方法获得。
8.根据权利要求7所述的巨噬细胞，用于医药和/或医学/药学研究。
9.根据权利要求7所述的巨噬细胞，用于疫苗生产。
10.一种GM-CSF衍生的连续复制的非转化猪巨噬细胞系。
1
12.一种连续复制的非转化猪巨噬细胞系统。
13.根据权利要求12所述的系统，其特征在于猪巨噬细胞标志物CD163、CD172a的表达。
14.一种用于生产连续复制的未转化猪巨噬细胞的方法，包括：
15.根据权利要求14所述的方法，进一步包括以下步骤：利用tsA58来转导来自所述饲养细胞培养物的漂浮巨噬细胞，以产生条件性永生化细胞系。
16.一种用于生产连续复制的未转化猪巨噬细胞的方法，包括：
17.一种用于生产连续复制的未转化猪巨噬细胞的方法，包括以下步骤：培养猪细胞，以分化出巨噬细胞；以及转导所述巨噬细胞，以产生永生化细胞系。
18.根据权利要求17所述的方法，其中利用tsA58来转导所述巨噬细胞。
19.一种自我更新的非转化巨噬细胞系，能够支持非洲猪瘟病毒复制。
20.一种细胞系，命名为PLTA58。
21.一种用于生产连续复制的非转化猪巨噬细胞的方法，包括：在添加了GM-CSF的培养基中培养来自猪器官的细胞制剂，从而将所述细胞群体分化成自我更新的非转化巨噬细胞。
22.一种GM-CSF依赖性的自我更新的非转化猪巨噬细胞系。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于生产连续复制的非转化猪巨噬细胞的方法，包括：在添加了gm-csf的培养基中培养来自猪器官的细胞制剂，从而将所述细胞群体分化成自我更新的非转化巨噬细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中利用饲养细胞来培养所述细胞制剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述饲养细胞包括间充质饲养细胞。
4.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中巨噬细胞的特征在于猪巨噬细胞标志物cd163、cd172a的表达。
5.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中巨噬细胞的特征在于integrin alpham(cd11b)和/或mhc ii类细胞表面受体(hla-dr)的表达。
6.根据上述权利要求中任一项所述的方法，基于猪胎儿脾细胞。
7.巨噬细胞，可以通过上述权利要求中任一项所述的方法获得。
8.根据权利要求7所述的巨噬细胞，用于医药和/或医学/药学研究。
9.根据权利要求7所述的巨噬细胞，用于疫苗生产。
10.一种gm-csf衍生的连续复制的非转化猪巨噬细胞系。
11.根据权利要求10所述的细胞系，其中巨噬细胞的特征在于猪巨噬细胞标志物cd163、cd172...
【专利技术属性】
技术研发人员：杰尔吉·费耶尔，贾斯蒂娜·洛帕特卡，
申请(专利权)人：普利茅斯大学，
类型：发明
国别省市：
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