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【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开的实施方案涉及用于边合成边测序(sbs)的双链多核苷酸的化学线性化的组合物和方法。序列表的参考本申请连同电子格式的序列表一起提交。该序列表作为创建于2022年12月16日的名称为sequence_listing_illinc_691wo.xml的.xml文件提供,该文件的大小为18.0kb。序列表的电子格式的信息全文以引用方式并入本文。
技术介绍
1、多种核酸测序方法是本领域已知的。美国专利5,302,509描述了一种用于对多核苷酸模板进行测序的方法,其涉及使用dna聚合酶或dna连接酶进行多个延伸反应以连续地掺入与模板链互补的标记的多核苷酸。在此类sbs反应中,通过连续掺入与模板链互补的单个核苷酸,在5'至3'方向上构建与模板链碱基配对的新多核苷酸链。在测序反应中所用的底物核苷三磷酸利用不同3'标记在3'位处进行标记,从而允许在添加连续核苷酸时测定掺入的核苷酸的同一性。
2、为了使核酸测序反应的通量最大化,有利的是能够并行对多个模板分子测序。可通过使用核酸阵列技术来实现多个模板的并行处理。这些阵列通常由固定到固体载体材料上的多核苷酸的高密度矩阵组成。
3、本领域已描述了用于制造固定化核苷酸测定的阵列的各种方法。wo 98/44151和wo 00/18957均描述了核酸扩增方法,其允许将扩增产物固定在固体载体上以便形成阵列,这些阵列由簇或“集落”组成,其中簇或“集落”由多条相同的固定化多核苷酸链和多条相同的固定化互补链形成。这种类型的阵列在本文中被称为“成簇阵列”。在根据这些方法制备的聚类阵列上的d
4、已知酶促方法促进寡核苷酸或多核苷酸的有效位点特异性裂解以使双链dna簇线性化并使表面结合的引物脱保护。目前,酶已经在各种测序应用中广泛用于这两种类型的反应。然而,酶促方法存在某些问题,包括酶稳定性、酶生产成本、特定储存和处理要求、酶活性的变化和测序读数中的高背景强度。因此,需要开发用于有效dna测序的替代线性化和脱保护方法。然而,在这种情况下,可以应用于线性化步骤的反应类型有许多限制,因为试剂、条件和副产物(a)必须与上游反应和下游反应(包括寡核苷酸杂交和变性、引物pcr延伸和dna合成)相容,(b)必须在酸性、碱性和氧化条件下表现出良好的稳定性,(c)必须实现快速和干净的化学反应,以及(d)必须不干扰核苷酸检测方法。本公开描述了用于化学裂解双链dna的组合物,其是满足上述要求的有效替代方案。
技术实现思路
1、本公开的一个方面涉及一种包含高碘酸盐和离子液体添加剂的组合物,其中高碘酸盐溶解在水溶液中,并且高碘酸盐在水溶液中不形成沉淀物。
2、在本文所述的组合物的一些实施方案中,高碘酸盐在组合物中的浓度为约0.1mm至约300mm、约0.5mm至约200mm、约1mm至约150mm、约2mm至约100mm或约5mm至约50mm。在一个实施方案中,高碘酸盐在组合物中的浓度为约10mm。在另一个实施方案中,高碘酸盐在组合物中的浓度为约25mm。
3、在本文所述的组合物的一些实施方案中,离子液体添加剂包含或冠醚或取代的咪唑鎓盐,或它们的组合。在一些此类实施方案中,冠醚包括或为15-冠-5。在其他实施方案中,取代的咪唑鎓盐包括或为氯化1-苄基-3-甲基咪唑鎓([bzmim]cl)。在一些实施方案中,组合物中15-冠-5与高碘酸盐的摩尔比为约1:1至约50:1、约5:1至约25:1或约10:1。在一些实施方案中,组合物中[bzmim]cl与高碘酸盐的摩尔比为约1:1至约100:1、约10:1至约50:1或约30:1。
4、在本文所述的组合物的一些实施方案中,组合物还包含一种或多种无机盐。例如,无机盐可以包括一种或多种钠盐,或一种或多种镁盐,或它们的组合。在另外的实施方案中,无机盐可以包括柠檬酸钠、乙酸钠、硫酸镁,或它们的组合。
5、在本文所述的组合物的一些实施方案中,组合物的ph为约4.0至约8.0、约5.0至约7.5或约6.0。在另外的实施方案中,在组合物经历至少5、6、7、8或9次冻/融循环之后,没有形成高碘酸盐的沉淀物。
6、在本文所述的组合物的任何实施方案中,高碘酸盐包括或为高碘酸钠。
7、本公开的另一方面涉及一种使多个固定化双链多核苷酸线性化的方法,所述方法包括:
8、使如本文所述的含有高碘酸盐的组合物与包含所述多个固定化双链多核苷酸的固体载体接触,每个双链多核苷酸包含第一链和第二链,其中所述第一链和所述第二链在它们的5'端处固定到所述固体载体,其中每条第二链包含裂解位点;以及
9、用所述高碘酸盐在所述裂解位点处使一条或多条第二链化学裂解,并产生一个或多个裂解的第二核酸。
10、在本文所述的线性化方法的一些实施方案中,所述方法还包括从固体载体移除裂解的第二核酸。在一些实施方案中,每条第二链的裂解位点包含一个或多个二醇连接基。在一些实施方案中,二醇连接基包含式(i)的结构:
11、其中r为2、3、4、5或6;并且s为2、3、4、5或6。在一个实施方案中,二醇连接基包含式(ia)的结构:
12、在另外的实施方案中,第二链多核苷酸包含p17序列。
13、本公开的另一方面涉及一种对多核苷酸进行测序的方法,所述方法包括:
14、使钯催化剂与包含多个固定化双链多核苷酸的固体载体接触,每个双链多核苷酸包含第一链和第二链,其中所述第一链和所述第二链在它们的5'端处固定到所述固体载体,其中每条第一链包含含有乙烯基部分的第一裂解位点,并且其中每条第二链包含含有一个或多个二醇连接基的第二裂解位点;
15、用所述钯催化剂在所述第一裂解位点处使一条或多条第一链裂解,并产生一个或多个裂解的第一核酸和裂解的固定化第一链;
16、从所述固体载体移除裂解的第一核酸;
17、对固定化第二链进行测序;
18、重新合成与所述第二链互补的衍生物第一链;
19、使如本文所述的含有高碘酸盐的组合物与一条或多条第二链接触以在所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种包含高碘酸盐和离子液体添加剂的组合物,其中所述高碘酸盐溶解在水溶液中,并且所述高碘酸盐在所述水溶液中不形成沉淀物。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述高碘酸盐包括高碘酸钠。
3.根据权利要求1或2所述的组合物,其中所述高碘酸盐在所述组合物中的浓度为约0.1mM至约300mM、约0.5mM至约200mM、约1mM至约150mM、约2mM至约100mM或约5mM至约50mM。
4.根据权利要求3所述的组合物,其中所述高碘酸盐在所述组合物中的浓度为约10mM或约25mM。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物,其中所述离子液体添加剂选自冠醚或取代的咪唑鎓盐,或它们的组合。
6.根据权利要求5所述的组合物,其中所述冠醚包括15-冠-5。
7.根据权利要求5所述的组合物,其中所述取代的咪唑鎓盐包括氯化1-苄基-3-甲基咪唑鎓([Bzmim]Cl)。
8.根据权利要求6所述的组合物,其中所述组合物中15-冠-5与所述高碘酸盐的摩尔比为约1:1至约50:1或约5:1至约25:1。
10.根据权利要求6所述的组合物,其中所述组合物中[Bzmim]Cl与所述高碘酸盐的摩尔比为约1:1至约100:1或约10:1至约50:1。
11.根据权利要求10所述的组合物,其中所述组合物中[Bzmim]Cl与所述高碘酸盐的摩尔比为约30:1。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物,所述组合物还包含一种或多种无机盐。
13.根据权利要求12所述的组合物,其中所述无机盐包括柠檬酸钠、乙酸钠或硫酸镁,或它们的组合。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物,其中所述组合物的pH为约4至约8,或约5至约7.5。
15.根据权利要求14所述的组合物,其中所述组合物的pH为约6。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物,其中在所述组合物经历至少5次冻/融循环之后,没有形成所述高碘酸盐的沉淀物。
17.一种使多个固定化双链多核苷酸线性化的方法,所述方法包括:
18.根据权利要求17所述的方法,所述方法还包括从所述固体载体移除所述裂解的第二核酸。
19.根据权利要求17或18所述的方法,其中每条第二链的所述裂解位点包含一个或多个二醇连接基。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述二醇连接基包含式(I)的结构:
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述二醇连接基包含式(Ia)的结构:
22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法,其中所述第二链多核苷酸包含P17序列。
23.一种对多核苷酸进行测序的方法,所述方法包括:
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述第一裂解位点包含修饰的核苷酸,所述修饰的核苷酸包含式(II)的结构:
25.根据权利要求23或24所述的方法,其中每条第一链从固定到所述固体载体的第一延伸引物延伸,并且其中所述第一延伸引物包含P15序列。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法,其中所述二醇连接基包含式(I)的结构:
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述二醇连接基包含式(Ia)的结构:
28.根据权利要求23至27中任一项所述的方法,其中每条第二链从固定到所述固体载体的第二延伸引物延伸,并且其中所述第二延伸引物包含P17序列。
29.一种用于双链多核苷酸的化学线性化的试剂盒,所述试剂盒包含高碘酸盐和离子液体添加剂,其中所述高碘酸盐和所述离子液体添加剂中的至少一者呈冻干形式。
30.根据权利要求29所述的试剂盒,其中所述高碘酸盐包括高碘酸钠。
31.根据权利要求29或30所述的试剂盒,其中所述离子液体添加剂选自冠醚或取代的咪唑鎓盐,或它们的组合。
32.根据权利要求31所述的试剂盒,其中所述冠醚包括15-冠-5。
33.根据权利要求31所述的试剂盒,其中所述取代的咪唑鎓盐包括氯化1-苄基-3-甲基咪唑鎓([Bzmim]Cl)。
34.根据权利要求32所述的试剂盒,其中15-冠-5与所述高碘酸盐的摩尔比为约1:1至约50:1、约5:1至约25:1或约10:1。
35.根据权利要求33所述的试剂盒,其中[Bzmim]Cl与所述高碘酸盐的摩尔比为约1:1至约100:1、约10:1至约50:1或...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种包含高碘酸盐和离子液体添加剂的组合物,其中所述高碘酸盐溶解在水溶液中,并且所述高碘酸盐在所述水溶液中不形成沉淀物。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述高碘酸盐包括高碘酸钠。
3.根据权利要求1或2所述的组合物,其中所述高碘酸盐在所述组合物中的浓度为约0.1mm至约300mm、约0.5mm至约200mm、约1mm至约150mm、约2mm至约100mm或约5mm至约50mm。
4.根据权利要求3所述的组合物,其中所述高碘酸盐在所述组合物中的浓度为约10mm或约25mm。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物,其中所述离子液体添加剂选自冠醚或取代的咪唑鎓盐,或它们的组合。
6.根据权利要求5所述的组合物,其中所述冠醚包括15-冠-5。
7.根据权利要求5所述的组合物,其中所述取代的咪唑鎓盐包括氯化1-苄基-3-甲基咪唑鎓([bzmim]cl)。
8.根据权利要求6所述的组合物,其中所述组合物中15-冠-5与所述高碘酸盐的摩尔比为约1:1至约50:1或约5:1至约25:1。
9.根据权利要求8所述的组合物,其中所述组合物中15-冠-5与所述高碘酸盐的摩尔比为约10:1。
10.根据权利要求6所述的组合物,其中所述组合物中[bzmim]cl与所述高碘酸盐的摩尔比为约1:1至约100:1或约10:1至约50:1。
11.根据权利要求10所述的组合物,其中所述组合物中[bzmim]cl与所述高碘酸盐的摩尔比为约30:1。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物,所述组合物还包含一种或多种无机盐。
13.根据权利要求12所述的组合物,其中所述无机盐包括柠檬酸钠、乙酸钠或硫酸镁,或它们的组合。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物,其中所述组合物的ph为约4至约8,或约5至约7.5。
15.根据权利要求14所述的组合物,其中所述组合物的ph为约6。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物,其中在所述组合物经历至少5次冻/融循环之后,没有形成所述高碘酸盐的沉淀物。
17.一种使多个固定化双链多核苷酸线性化的方法,所述方法包括:
18.根据权利要求17所述的方法,所述方法还包括从所述固体载体移除所述裂解的第二核酸。
19.根据权利要求...
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