利用RT-PCR法进行家蚕相对强健品种选择的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用RT-PCR法进行家蚕相对强健品种选择的方法：选用饲养至5龄第2天的家蚕，对每种家蚕均依次进行如下步骤1)～5)：1)将家蚕进行高温冲击处理；2)将高温冲击处理家蚕以及饲养至5龄第2天的家蚕分别处死后进行解剖提取脂肪体；3)对脂肪体进行RNA抽提；4)以提取的RNA为模板进行反转录；5)利用所得的cDNA进行热激蛋白基因的荧光定量PCR检测，得热激蛋白基因表达量；5龄第2天家蚕的基因荧光表达量为X1，高温冲击后家蚕的基因荧光表达量为X2，X1+2(X2－X1)＝Y；6)将不同品种的家蚕所对应的Y进行比对，Y值大的所对应的家蚕为家蚕相对性强健品种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种家蚕品种的辅助选育方法，具体地说，是涉及一种利用RT-PCR法进行家蚕强健性品种选择的方法。
技术介绍
中国是世界养蚕业的发源地，具有五千年的悠久历史。栽桑养蚕曾经是广大农村经济发展的支柱和农民脱贫致富的重要手段；蚕丝业也是传统的出口创汇产业，为国民经济建设作出了重要贡献。家蚕新品种选育是蚕丝业科技进步的基础和核心之一，在新中国成立后，我国的家蚕品种选育取得了巨大的成就，在全国范围内先后进行了多次蚕品种的更新换代，极大地促进了蚕丝业的发展。但随着农村经济的快速发展，第二、三产业的迅猛崛起，大量农村劳动力涌入工商企业，从事养蚕业的大多为老弱及妇女，传统的精细饲养方法已不适合当今时代发展的需要，需要有一种能适合省力化、粗放经营的蚕品种；另一方面，家蚕作为实验材料及生物反应器的优异特性正逐步得到社会的肯定，利用家蚕生产具有高科技含量的生物制品已经取得重大进展，迫切需要有一种能周年进行饲养的强健性蚕品种。传统的强健性蚕品种的选育大多采用诱发鉴定方法，即人工创造所需的不良环境(高温多湿、添食各种病毒、病菌及微量农药或污染物)，促使参加鉴定的品种暴露出遗传本质差异，达到筛选鉴定的目的，但这种方法需要将家蚕饲养至上簇、结茧及化蛹，通过调查这些性状了解该品种的强健性，时间周期长，而且浪费大量的人力物力。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种利用RT-PCR法进行家蚕相对强健性品种选择的方法，采用本专利技术可选择得到相对强健的品种。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种利用RT-PCR法进行家蚕相对强健品种选择的方法：选用饲养至5龄第2天的家蚕，以至少2种的家蚕作为待测对象，对每种家蚕均依次进行如下步骤1)～5)：1)、将家蚕进行高温冲击处理，所述高温冲击处理为：将饲养至5龄第2天的家蚕于34.5～35.5℃放置3.5～4.5小时；2)、将高温冲击处理家蚕以及饲养至5龄第2天的家蚕分别处死后进行解剖提取脂肪体；3)、对步骤2)所得的脂肪体进行RNA抽提；4)、以提取的RNA为模板进行反转录，得cDNA；5)、利用所得的cDNA进行热激蛋白基因的荧光定量PCR检测，得热激蛋白基因表达量；5龄第2天家蚕的基因荧光表达量为X1，高温冲击后家蚕的基因荧光表达量为X2，X1+2(X2－X1)＝Y；6)、将不同品种的家蚕所对应的Y进行比对，Y值大的所对应的家蚕为家蚕相对性强健品种。备注说明：本专利技术是将所得的每种家蚕所对应的热激蛋白基因(shsp23.7)表达量进行比对，选择大的热激蛋白基因表达量所对应的家蚕为家蚕相对性强健品种。荧光定量中目的基因(即，热激蛋白基因，亦称标记基因)表达量大的个体为抗高温的个体，其对高温等不良环境的抵抗性强，因此作为强健性品种留种。高温指34.5～35.5℃(特别指35℃)。备注说明：待测对象最终所得的Y值之间的差距越大，越能精确的说明Y值大的所对应的为家蚕相对强健品种。一般而言，Y大于10，可被认定为家蚕相对强健品种。作为本专利技术的利用RT-PCR法进行家蚕相对性强健品种选择的方法的：所述步骤5)的PCR检测体系为PCR检测条件为：95℃，3min；95℃变性15sec，60℃退火40sec，72℃延伸40sec，共循环40个循环；72℃10min。LightCycler480操作系统(Roche罗氏)。作为本专利技术的利用RT-PCR法进行家蚕相对性强健品种选择的方法的进一步改进：所述PCR检测体系中的引物(标记基因的引物)为：SEQ ID NO 1:5’-ATGAAGAATTTCATTCC-3’SEQ ID NO 2:5’-TTATTGCATTTCTGAC-3’。作为本专利技术的利用RT-PCR法进行家蚕相对性强健品种选择的方法的进一步改进：所述高温冲击处理温度为35℃，时间为4小时。在本专利技术中：步骤1)按常规饲养技术饲养家蚕，从而获得饲养至5龄第2天的家蚕。步骤2)的“处死”为常规的处死方式，例如进行放血处死。步骤3)的对脂肪体进行RNA抽提属于常规技术，例如可按照Trizol提取试剂盒(Total RNA Extractor，SK1312)介绍的方法进行抽提。步骤4)的“以提取的RNA为模板进行反转录”属于常规技术，例如可按照AMV First Strand cDNA Synthesis Kit介绍的方法进行。本专利技术所述的热激蛋白基因shsp23.7在已经公开发表的《Biesei.Biotechnol.Biochem.,2006,70(10):2443-2450》中明确告知了其具体序列。本专利技术提供的利用RT-PCR法进行强健性家蚕品种选择的方法，该方法主要涉及用荧光定量PCR技术，检测与家蚕强健性相关的基因表达量。本专利技术的有益效果在于：用热激蛋白基因为标记基因，并通过高温处理激发其表达，可以准确有效的选择强健性个体，从而大幅度的改进家蚕强健性状，提高育种效率。传统的育种方法需要饲养至上簇、结茧及化蛹，然而调查其生存率。选育周期长、选择效率不高；而且饲养至上簇及化蛹等需要浪费大量的人力物力。而应用该方法只要饲养至5龄第2天，通过选择热激蛋白基因表达量高的个体，其家蚕强健性就高，选种效率可以提高30-50％以上。综上所述，本专利技术提供的方法，能够在5龄第2天通过检测热激蛋白基因的表达量就可以判断该品种是否强健，大大缩短品种选育的周期，从而减少人力物力的浪费。具体实施方式实施例1、一种利用RT-PCR法进行家蚕相对性强健品种选择的方法，以至少2种的家蚕(具体为按常规饲养技术饲养至5龄第2天的家蚕)作为待测对象，对每个品种的家蚕均依次进行如下步骤1)～4)：1)、从每一品种中选取若干幼虫个体，每个幼虫个体进行编号，随机分成两部分：一部分处死后解剖提取脂肪体；另一部分35℃高温冲击(放置)4hr处死后解剖提取脂肪体；2)、将上述两种材料(即，2种脂肪体)按Trizol提取试剂盒(Total RNA Extractor，SK1312)介绍的方法进行RNA抽提；进行常规的电泳检测RNA提取效果(1.5％琼脂糖，1×TAE电泳缓冲液)；3)反转录：以提取的RNA为模板进行反转录(AMV First Strand cDNA Synthesis Kit，SK2445)；得cDNA；4)、荧光定量PCR检测：将上述cDNA样品作为模板，SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示的碱基序列合成的DNA为引物，用ABI Sy本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用RT‑PCR法进行家蚕相对强健品种选择的方法，其特征是：选用饲养至5龄第2天的家蚕，以至少2种的家蚕作为待测对象，对每种家蚕均依次进行如下步骤1)～5)：1)、将家蚕进行高温冲击处理；所述高温冲击处理为：将饲养至5龄第2天的家蚕于34.5～35.5℃放置3.5～4.5小时；2)、将高温冲击处理家蚕以及饲养至5龄第2天的家蚕分别处死后进行解剖提取脂肪体；3)、对步骤2)所得的脂肪体进行RNA抽提；4)、以提取的RNA为模板进行反转录，得cDNA；5)、利用所得的cDNA进行热激蛋白基因的荧光定量PCR检测，得热激蛋白基因表达量；5龄第2天家蚕的基因荧光表达量为X1，高温冲击后家蚕的基因荧光表达量为X2，X1+2(X2－X1)＝Y；6)、将不同品种的家蚕所对应的Y进行比对，Y值大的所对应的家蚕为家蚕相对性强健品种。

【技术特征摘要】
1.利用RT-PCR法进行家蚕相对强健品种选择的方法，其特征是：选用饲养至5龄第2天
的家蚕，以至少2种的家蚕作为待测对象，对每种家蚕均依次进行如下步骤1)～5)：
1)、将家蚕进行高温冲击处理；所述高温冲击处理为：将饲养至5龄第2天的家蚕于
34.5～35.5℃放置3.5～4.5小时；
2)、将高温冲击处理家蚕以及饲养至5龄第2天的家蚕分别处死后进行解剖提取脂肪体；
3)、对步骤2)所得的脂肪体进行RNA抽提；
4)、以提取的RNA为模板进行反转录，得cDNA；
5)、利用所得的cDNA进行热激蛋白基因的荧光定量PCR检测，得热激蛋白基因表达
量；
5龄第2天家蚕的基因荧光表达量为X1，高温冲击后家蚕的基因荧光表达量为X2，X1+2
(X2－X1)＝Y；
6)、将不同品种的家蚕所对应的...

【专利技术属性】
技术研发人员：屠振力，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33