一种基于DART-MS/MS测定家蚕中谷丙转氨酶活力的方法技术

一种基于DART-MS/MS测定家蚕中谷丙转氨酶活力的方法,包括如下步骤：(1)DART-MS/MS检测；(2)谷丙转氨酶活力单位；(3)谷丙转氨酶活力计算公式；(4)谷丙转氨酶活力测定。本发明专利技术采用DART-MS/MS作为检测手段，可直接检测酶反应过程中的生成物丙氨酸，该方法具有检测快速、检测灵敏度高，抗干扰能力强和定量准确等特点。本发明专利技术在检测过程中不需要加入2,4-二硝基苯肼避免了污染和干扰。该方法操作简便、检测快速，便于推广和应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种采用实时直接分析离子源(DART)测定家蚕中谷丙转氨酶活力的方法。
技术介绍
丙氨酸是蚕丝中的主要成分，其含量在30％以上，而家蚕的主要食物桑叶中丙氨酸的含量很低，家蚕为了给蚕丝蛋白提供更多的丙氨酸，通过体内的谷丙转氨酶将其他氨基酸转化为丙氨酸。所以家蚕体内的谷丙转氨酶活力影响着蚕丝蛋白的合成，进而影响蚕丝的产量。因此，开发快速、高效、灵敏的新型检测技术来检测家蚕中谷丙转氨酶的活力对于蚕丝产量的评估和这个蚕业的发展有着重要的意义。传统的谷丙转氨酶测定方法为赖氏法[1-4]，该方法采用谷氨酸与丙酮酸钠作用形成丙氨酸钠及a-酮戊二酸，反应完成后，残余的丙酮酸钠与2,4一二硝基苯肼作用，生成二硝基苯踪，在碱性条件下呈棕色。然后采用分光光度计进行检测。但是该方法存在以下问题，首先反应底物酮戊二酸容易与2,4-二硝基苯肼反应生成红棕色的苯腙硝醌，干扰检测结果，需要采用其他繁琐的方法进行校正。同时，2,4-二硝基苯肼为易燃易爆物，在存储方面要求较高。另外，采用赖氏法反应后生成的硝基苯肼和苯腙硝醌处理困难，极易造成环境污染。最后，该方法所采用的检测器为分光光度计，检测灵敏度较低。实时直接分析(DirectAnalysis in Real Time)简称DART，是一种热解析和离子化技术，DART能在几秒钟内分析存在于气体、液体、固体或材料表面的化合物，从而对样品无损耗定性和定量分析。在本专利技术中，采用DART作为离子源检测谷丙转氨酶的活力在研究中尚属首次。通过我们的检测方案，可直接检测反应生成物丙氨酸，与传统的赖氏法相比，在检测过程中不需要生成物再与其他成分进行显色反应，简化了检测实验步骤，在检测过程中也避免了2,4-二硝基苯肼的使用，解决了生产物干扰和环境污染的问题。同时该方法，相较于传统的赖氏法分光光度计检测，其检测灵敏度更高、重现性更好、定量更加快速。因此，该方法比传统的赖氏检测法具有明显的优势，适于代替赖氏检测法进行推广应用。[1]刘限,李青峰,许方国,王英春.柞蚕不同品种中、后部丝腺细胞数目及谷丙转氨酶活性的测定分析.蚕业科学,2003,29(2):200-202.[2]徐镜波,张淑.月鲤鱼血清谷丙转氨酶活性和活性抑制的测定.松辽学刊,1991,4,4-8.[3]陈晨,黄峰,舒秋艳,张丽,周艳萍.共轭亚油酸对草鱼生长、肌肉成分、谷草转氨酶 及谷丙转氨酶活性的影响.水生生物学报,2010,34(3),647-651.[4]陈钧辉,陶力,李俊,等.生物化学实验(第三版).科学出版社.2006,190-210
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供一种基于DART-MS/MS测定家蚕中谷丙转氨酶活力的方法，在测定中以DART作为离子源，可直接检测生成物丙氨酸，定量更加灵敏准确，同时测定反应中不需要加入2,4-二硝基苯肼的使用，避免了干扰和环境污染。技术方案：一种基于DART-MS/MS测定家蚕中谷丙转氨酶活力的方法，包括如下步骤：(1)DART-MS/MS检测：采用DART离子源和三重四级杆质谱在正离子模式或负离子模式下对丙氨酸进行检测，载气为氮气，加热温度为200-500℃，Gridvoltage范围为100-400V，气压为0.2-0.5MPa，检测方式为反应监测模式(SRM)，碰撞电压为0-200eV，碰撞气压为0-5mTorr；(2)谷丙转氨酶活力单位：谷丙转氨酶活力定义为1mL的酶液在38±1℃，水浴10min，生成1μmol丙氨酸的量作为1个酶活力单位，活力单位为U/mL；(3)谷丙转氨酶活力计算公式：(4)谷丙转氨酶活力测定：测定组：将家蚕后部丝腺组织液与5mmol/L的谷氨酸溶液、4mmol/L丙酮酸钠、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液按照1:1:1:2的体积比例进行充分混合，在38±1℃恒温水浴锅中反应10min，放入70℃水浴30min-1h，将得到的反应液按照步骤(1)中所给条件进行DART检测；空白组：采用超纯水代替测定组中的家蚕后部丝腺组织液液，其他条件与测定组一致进行反应，然后将得到的反应液按照步骤(1)中所给条件进行DART检测。所述加热温度优选为500℃。所述Gridvoltage范围优选为100V。所述气压优选为0.5MPa。所述碰撞电压优选为10eV。所述碰撞气压优选为1.5mTorr。有益效果：本专利技术采用DART-MS/MS作为检测手段，可直接检测酶反应过程中的生成物丙氨酸，该方法具有检测快速、检测灵敏度高，抗干扰能力强和定量准确等特点。本专利技术在检测过程中不需要加入2,4-二硝基苯肼避免了污染和干扰。该方法操作简便、检测快速，便于推广和应用。附图说明图1为离子模式下，丙氨酸的一级质谱图；图2为正离子模式下质荷比90.0的子离子CID质谱图；图3为丙氨酸标准曲线。具体实施方案主要仪器：TSQ Quantum Access MAX三重四级杆液质联用仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，DART离子源(美国IonSense公司)，EL20pH计(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)，AH-S2、AH-S8数显恒温水浴锅(江苏金坛医疗器械有限公司)。仪器指标：TSQ Quantum Access MAX三重四级杆液质联用仪，一级质谱扫描质量范围为50-400，二级质谱子离子扫描质量范围为50-300。标准曲线：(1)DART-MS/MS检测：采用DART离子源和三重四级杆质谱在正离子模式下对丙氨酸进行检测，载气为氮气，加热温度为500℃，Grid voltage范围为100V，气压为0.5MPa，扫描后得到一级质谱图(见图1)和二级质谱图(见图2)，从而确定离子对为 用超纯水将5mmol/L的丙氨酸溶液分别稀释成2.5、1.25、0.63和0.31mmol/L，然后按照基质溶液:丙氨酸＝4:1的体积比例配置成丙氨酸标准溶液，在SRM模式下进行检测，碰撞电压为10eV，碰撞气压1.5mTorr，每个浓度测量6次，将所得结果绘制成标准曲线，标准曲线为Y＝112433804X-4306759(见图3)，R2＝0.997。(2)谷丙转氨酶活力单位：谷丙转氨酶活力定义为1mL的酶液在38±1℃，水浴10min，生成1μmol丙氨酸的量作为1个酶活力单位，活力单位为U/mL。(3)谷丙转氨酶活力计算公式：实施例1测定组：将五龄后第二天的家蚕后部丝腺组织液与5mmol/L的谷氨酸溶液、4mmol/L丙酮酸钠、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液按照1:1:1:2的比例进行充分混合，在38±1℃恒温水浴锅中反应10min，放入70℃水浴30min-1h，将得到的反应液按照步骤(1)中所给条件进行DART检测。空白组：将0.2mL的超纯水代替测定组中的酶液，其他条件与测定组一致进行反应，然后将得到的反应液按照步骤(1)中所给条件进行DART检测。将质谱测定值带入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于DART‑MS/MS测定家蚕中谷丙转氨酶活力的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)DART‑MS/MS检测：采用DART离子源和三重四级杆质谱在正离子模式或负离子模式下对丙氨酸进行检测，载气为氮气，加热温度为200‑500℃，Grid voltage范围为100‑400V，气压为0.2‑0.5MPa，检测方式为反应监测模式(SRM)，碰撞电压为0‑200eV，碰撞气压为0‑5mTorr；(2)谷丙转氨酶活力单位：谷丙转氨酶活力定义为1mL的酶液在38±1℃，水浴10min，生成1μmol丙氨酸的量作为1个酶活力单位，活力单位为U/mL；(3)谷丙转氨酶活力计算公式：(4)谷丙转氨酶活力测定：测定组：将家蚕后部丝腺组织液与5mmol/L的谷氨酸溶液、4mmol/L丙酮酸钠、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液按照1:1:1:2的体积比例进行充分混合，在38±1℃恒温水浴锅中反应10min，放入70℃水浴30min‑1h，将得到的反应液按照步骤(1)中所给条件进行DART检测；空白组：采用超纯水代替测定组中的家蚕后部丝腺组织液液，其他条件与测定组一致进行反应，然后将得到的反应液按照步骤(1)中所给条件进行DART检测。...

【技术特征摘要】
1.一种基于DART-MS/MS测定家蚕中谷丙转氨酶活力的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)DART-MS/MS检测：采用DART离子源和三重四级杆质谱在正离子模式或负离子模式下对丙氨酸进行检测，载气为氮气，加热温度为200-500℃，Grid voltage范围为100-400V，气压为0.2-0.5MPa，检测方式为反应监测模式(SRM)，碰撞电压为0-200eV，碰撞气压为0-5mTorr；
(2)谷丙转氨酶活力单位：谷丙转氨酶活力定义为1mL的酶液在38±1℃，水浴10min，生成1μmol丙氨酸的量作为1个酶活力单位，活力单位为U/mL；
(3)谷丙转氨酶活力计算公式：
(4)谷丙转氨酶活力测定：
测定组：将家蚕后部丝腺组织液与5mmol/L的谷氨酸溶液、4mmol/L丙酮酸钠、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液按照1:1:1:2的体积比例进行充分混合，在38±1℃恒温水浴锅中反应10min，放入70℃水浴30min-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：武国华，张东阳，唐博志，李龙，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32