一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途制造技术

本发明专利技术公开了一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途，特异性LAMP引物根据Msp5基因设计3对引物：外，内，环引物，正向外引物命名为Msp5-F3b，反向外引物命名为Msp5-B3b，正向内引物命名为Msp5-FIPb，反向内引物命名为Msp5-BIPb，为了加速反应设计环路引物，其中包括正向环引物Msp5-LFb和反向环引物Msp5-LBb，三对的外引物用于PCR检测。在63℃条件下进行LAMP反应20分钟后，LAMP产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳显示呈阶梯状图案。该方法具有高特异性，高灵敏度，时间短且操作简便的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，涉及一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途。
技术介绍
牛边缘无浆体病是一种由边缘无浆体经蜱传播的专性寄生于红细胞内的血液传染疾病，主要引起牛、羊等反刍动物发病，。其特征为高热、贫血、消瘦、黄疸和胆囊肿大并广泛分布于世界热带和亚热带地区引起奶牛和肉牛产业相当大的经济损失(Katherine et al.，2010)。检测牛边缘无浆体的常见基因包括16S rRNA，热休克蛋白(groEL基因)(Lew et al.，2003)，主要表面蛋白-1a(Msp1a)(Lew et al.，2002；Molad et al.，2004)，Msp4(Molad et al.，2004)和Msp5(Molad et al.，2004；Corona et al.，2009)。牛边缘无浆体主要表面蛋白Msp5是由633bp单拷贝基因编码高度保守的19ku的蛋白，在免疫印迹试验中通过与单克隆抗体表面蛋白结合，Msp5 ANAF16C1证明在已知的无浆体属的几个亚种中是高度保守的(Visser et al.，1992；et al.，2012)。因此，Msp5可以作为一种有效的诊断抗原。传统的检测边缘无浆体Msp5基因的方法是竞争性酶联免疫吸附法(CELISA)(Strik et al.，2007；Echaide et al.，1998)竞争抑制性酶联免疫吸附法(CI-ELISA)(NI et al.，2011)，间接荧光抗体试验(IFAT)(OIE，2009)，套式PCR法(Echaide et al.，1998)，实时荧光定量PCR(Picoloto et al.，2010)和半套式PCR测定法(Singh et al.，2012)。但是这些方法还有许多缺陷，例如，它们必须在实验室进行并且反应需要很长的时间。自2000年以来，Notomi开发出了环介导等温扩增方法(LAMP)，在恒温条件(60℃-65℃)下，不到1h的时间里进行核酸扩增，具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点。环介导等温扩增技术已经广泛应用于快速检测动物病原(病毒、细菌、寄生虫)(Tomita et al.，2008)。然而，使用LAMP技术诊断牛边缘无浆体病尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途，根据牛边缘无浆体保守基因Msp5设计了引物，评估LAMP技术的检测方法。其具体技术方案为：一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途，特异性LAMP引物根据Msp5基因设计3对引物：外，内，环引物，正向外引物命名为Msp5-F3b，反向外引物命名为Msp5-B3b，正向内引物命名为Msp5-FIPb，反向内引物命名为Msp5-BIPb，为了加速反应设计环路引物，其中包括正向环引物Msp5-LFb和反向环引物Msp5-LBb，三对的外引物用于PCR检测；优选地，采用以下步骤完成：LAMP反应体系是25μL，包括0.4μM外引物(Msp5-F3和Msp5-B3)，1.6μM内引物(Msp5-FIP和Msp5-BIP)，0.8μM环引物(Msp5-LF和Msp5-LB)，1μLDNA样品，硫酸镁1mM dNTP Mix1mM(TAKARA BIO INC.，Japan)，1mM甜菜碱(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，2.5μL10×Thermopol buffer(New England Biolabs，Inc.，MA)1U的Bst DNA聚合酶(New England Biolabs，Inc.，MA)，加ddH2O共25μL。混匀后，加入20μL油(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)混匀并离心。在PCR管的中下部加入0.5μL SYBR GREEN I染料(Sigma-Aldrich St.Louis，MO)然后轻轻盖上，以防止SYBR GREEN I染料降入管底。将混合物在63℃下恒温反应20分钟。反应后，在光亮视野下观察到混合物与SYBR GREEN I染料在PCR管中的颜色变化，并在紫外线照射下365nm处也可观察到。之后LAMP产物(3μL)用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术使用Msp5基因的保守区作为特异性引物的扩增区域用LAMP法来诊断边缘无浆体。与常规PCR扩增方法相比，LAMP法更快速，经济适用于牛边缘无浆体的临床诊断。LAMP不需要特殊的设备和昂贵的试剂，而且该反应可在一个恒定温度的水浴中进行20分钟，并在紫外线照射或通过目视观察颜色的变化来确定LAMP的结果。在特异性方面，LAMP方法显示了与PCR的方法扩增其他四个血源性寄生虫的基因组DNA类似的特异性。在敏感性方面，LAMP法比PCR法灵敏。在LAMP反应溶液中加入20μL油以防止挥发，并防止溶液接触SYBR GREEN I染料在PCR管的中部。在反应之前加入SYBR GREEN I染料为了避免产生气雾和假阳性。因此LAMP是一种高特异性，高灵敏度，时间短且操作简便，等温条件下快速检测临床样本的方法。附图说明图1是引物扩增效果图，其中，图1A为外引物分别进行PCR反应效果图，1和2：外引物PCR扩增结果；3：阴性对照；图1B为引物和牛边缘无浆体病基因组DNA作为模板应用LAMP方法的效果图，1和2：LAMP引物扩增结果；3：阴性对照；M：DL2000marker图2是电泳分析LAMP反应时间琼脂糖凝胶电泳，1-6：LAMP反应时间分别为10、20、30、40、50、60min；M：DL2000marker；图3是牛边缘无浆体特异性检测结果，图3A牛边缘无浆体和4种血液寄生虫的PCR检测结果；图3B牛边缘无浆体和4种血液寄生虫的LAMP检测结果，1-6分别为贝氏贝诺孢子虫、锥体虫、弓形虫、双芽巴贝斯虫、阴性对照和牛边缘无浆体M：DNA Marker(DL2000)；图4是牛边缘无浆体敏感性检测结果，图4A牛边缘无浆体的PCR敏感性检测结果；图4B牛边缘无浆体的LAMP敏感性检测结果，1-9：分别为牛边缘无浆体DNA模板的10-0，10-1，10-2......10-8倍稀释，10为阴性对照；M：DNA Marker(DL2000)。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。牛边缘无浆体全基因组DNA来自黑龙江八一农垦大学动物科技学院免疫微生物实验室。贝氏贝诺孢子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途，其特征在于，特异性LAMP引物根据Msp5基因设计3对引物：外，内，环引物，正向外引物命名为Msp5‑F3b，反向外引物命名为Msp5‑B3b，正向内引物命名为Msp5‑FIPb，反向内引物命名为Msp5‑BIPb，为了加速反应设计环路引物，其中包括正向环引物Msp5‑LFb和反向环引物Msp5‑LBb，三对的外引物用于PCR检测；Msp5‑F3b ACCTTCTGCTGTTCGTTGMsp5‑B3b GAGAAGCCATGCCTAACTCMsp5‑FIPb GTTGAAAGACGCGGAGGCTAAATCGGCGA(F1c+F2) GAGGTTTACMsp5‑BIPb CCGTCAGTAGCGGCGATTTGTACTTACAGG(B1c+B2) CTGAGAAGCMsp5‑LFb TGCCCTCACTTACAACTTCGMsp5‑LBb CGGCAAGCACATGTTGGTA。

【技术特征摘要】
1.一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途，其特征在
于，
特异性LAMP引物根据Msp5基因设计3对引物：外，内，环引物，正向外引物命名为
Msp5-F3b，反向外引物命名为Msp5-B3b，正向内引物命名为Msp5-FIPb，反向内引物命名
为Msp5-BIPb，为了加速反应设计环路引物，其中包括正向环引物Msp5-LFb和反向环引物
Msp5-LBb，三对的外引物用于PCR检测；
Msp5-F3b ACCTTCTGCTGTTCGTTG
Msp5-B3b GAGAAGCCATGCCTAACTC
Msp5-FIPb GTTGAAAGACGCGGAGGCTAAATCGGCGA
(F1c+F2) GAGGTTTAC
Msp5-BIPb CCGTCAGTAGCGGCGATTTGTACTTACAGG
(B1c+B2) CTGAGAAGC
Msp5-LFb TGCCCTCACTTACAACT...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪宏波，王欣，王云光，安先全，蒋慧婷，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23