一种柑橘溃疡病菌的DNA水浴沉淀提取方法技术

本发明专利技术一种柑橘溃疡病菌的DNA水浴沉淀提取方法。本发明专利技术方法将新鲜菌体加入洗涤缓冲液洗涤、再经裂解缓冲液水浴，抽提缓冲液及饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液抽提，乙醇洗涤沉淀后，晾干加入灭菌ddH2O溶解沉淀，在﹣20℃保存即可。本发明专利技术能够快速有效地提取到柑橘溃疡病菌的模板DNA，简捷快速。本法不需要特别的仪器，实验成本相对较低。使用本发明专利技术方法制备的DNA样品能够满足PCR方法对柑橘溃疡病菌进行分子诊断的需要。因此本发明专利技术建立了用水浴法快速抽提柑橘溃疡病菌的模板DNA的方法，为应用PCR技术进行早期诊断和预知检测提供基础和技术储备。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DNA提取方法，尤其是一种柑橘溃疡病菌的DNA水浴沉淀提取方法。
技术介绍
柑橘溃瘍病是由地毪草黄单胞杆菌柑橘致病变种、Xanthomonas axonopodis pv.citri)引起的一种国内外检疫性病害，严重影响柑橘安全生产和对外贸易，被列入2007年公布的《中国人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。该病害可通过带菌的种苗、接穗和果实等柑橘材料远距离传播，雪柑、甜橙、脐橙和四季柚等品种发生较为严重。引起该病害的病菌在叶、枝梢及果实的病斑中越冬，翌年春条件适宜时从病部溢出，借风雨、昆虫传播，经寄主的气孔、皮孔和伤口侵入。使叶片、嫩梢和果实发病，目前国内外除挖除病树烧毁外，尚无更好的根除办法。 目前柑橘溃疡病的检疫大多数以田间诊断为主，在一般情况下完全可凭肉眼判断，但症状不明显或未显现症状的带菌植株判断比较困难，易与其他病害混淆，同时由于黄单胞菌的种类及变种繁多，针对柑橘溃疡病的生化鉴定十分繁杂和困难。目前人们常用的柑橘溃疡病菌检测方法包括致病性、噬菌体检测法和血清学检测法等。随着分子生物学的发展，基于DNA的分子标记开始应用于不同病害的检测，由于该法直接以DNA的形式出现，可以较其他的田间诊断更为准确。因此，建立一种柑橘溃疡病菌DNA提取的方法，不仅能用于柑橘溃疡病菌的分子鉴定，还可以用于柑橘溃疡病菌基因的特异扩增，为其功能基因组研究奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决上述现有技术的不足，提供了一种可以快速抽提柑橘溃疡病菌的DNA的方法，以全面了解柑橘溃疡病菌的生物多样性，从而更好的为柑橘溃疡病的防控提供依据。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是按以下步骤进行 (a)将新鲜菌体加入洗涤缓冲液充分混合，使细菌细胞沉淀，弃上清液； (b)往步骤(a)制得的沉淀中加入裂解缓冲液，振荡悬浮，并于65°C水浴，完全反应； (c)加入65°C预热的抽提缓冲液，充分混合，加入等体积饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液抽提，离心使变性的蛋白沉淀，取上清液； (d)按照体积比为1:2的比例往步骤(c)制得的上清液中加入无水乙醇，-20°C放置待充分反应后，再高速离心至沉淀完全去上清液，加入体积浓度为70 %的乙醇洗涤沉淀，晾干后加入灭菌ddH20溶解沉淀，-20°C保存备用。步骤(a)中，每0. 12 g样品中加入洗涤缓冲液I mL ;所述洗涤缓冲液组成为50 mmol/L Tris，即三羟甲基氨基甲烷，pH 7. 7 ；25 mmol/L EDTA，S卩乙二胺四乙酸；0. I %PVP，即聚乙烯吡咯烷酮。步骤(b)中，每0. 12 g样品中加入裂解缓冲液50 u L ;所述裂解缓冲液组成为50mmol/L Tris，pH 8. 0 ；25 mmol/L EDTA ；3. 0 % SDS,即十二烷基硫酸钠；1. 2 % PVP。水浴时间 5-10 min。步骤(c)中，每0. 12 g样品中加入抽提缓冲液400 U L ;所述抽提缓冲液组成为50 mmol/L Tris, pH 8. 0 ；25 mmol/L EDTA ；3.0 % SDS ；1.2 % PVP。步骤(c)中，饱和酚氯仿异戊醇体积比为25:24:1。本专利技术的效果是，本专利技术使用水浴法能够快速有效地提取到柑橘溃疡病菌的模板DNA，简捷快速。此外本法不需要特别的仪器，实验成本相对较低。使用本专利技术方法制备的DNA样品能够满足PCR方法对柑橘溃疡病菌进行分子诊断的需要。因此本专利技术建立了用水浴法快速抽提柑橘溃疡病菌的模板DNA的方法，为应用PCR技术进行早期诊断和预知检测提供基础和技术储备。附图说明图I :柑橘溃疡病菌DNA的琼脂糖凝胶电泳图。·图中，Marker从生物公司购买的DNA分子量标准(DL 2000 DNA ladder)，1、2分别代表平行样，数字为DNA的大小，单位为bp。图2 :PCR扩增柑橘溃疡病菌DNA的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。图中，Marker从生物公司购买的DNA分子量标准(IOObp DNA ladder), 1、2分别代表柑橘溃疡病菌DNA的PCR产物平行样，数字为DNA的大小，单位为bp。具体实施例方式下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例I :使用本专利技术所述的方法对柑橘溃疡病菌DNA的提取 I、称取0.12 g新鲜菌体加入I. 5 mL离心管中，加入洗涤缓冲液I mL，在混合器上振荡30 S，然后6，000 rpm离心2 min使细菌细胞沉淀，弃上清液。所述洗涤缓冲液组成为50mmol/L Tris, pH 7. 7，25 mmol/L EDTA，0. I % PVP。2、在洗涤过的样品中加入裂解缓冲液50 UL，振荡悬浮，并于65 °C水浴中处理5-10 min，完全反应。所述裂解缓冲液组成为50mmol/L Tris, pH 8. 0,25 mmol/L EDTA, 3. 0 % SDS,I.2 % PVP。3、加入400 UL 65 °C预热的抽提缓冲液，振荡充分混匀，加入等体积饱和酚氯仿异戊醇(25:24:1)溶液抽提，10，000 rpm离心5 min使变性的蛋白沉淀，取上清液。所述抽提缓冲液组成为50mmol/T, Tris, pH 8.0,1 mmol/L EDTA,0. 3% mol/LNaCl，0. I % PVP04、另取上清液400 y L与1.5 mL离心管中，并加入800 UL预冷的无水乙醇，置-20 箱中冷冻30 min - 60 min促使沉淀形成；12，000 rpm离心10 min沉淀DNA,并弃去上清液；用I mL 70 % (V/V)乙醇洗涤沉淀，然后尽量弃去乙醇，自然晾干,使乙醇挥发完全，但不能使沉淀过于干燥，否则很难溶解；加入30 UL灭菌ddH20溶解沉淀，-20 V保存备用。5、DNA片段大小的琼脂糖凝胶电泳检测 取5 UL DNA核酸用I. 2 %的琼脂糖凝胶电泳检测，用2 U L核酸染料Goldview I进行染色检测，所用的DNA分子量标准(Marker)为北京天根生化有限公司的DL 2000 DNAladder，所用的电泳缓冲液为I X TAE电泳缓冲液，以120 V的电压预电泳5 min，然后100V电压预电泳50 min。电泳结束以后的凝胶在美国BIORAD公司的Gel Doc 2000凝胶成像系统拍照检测，结果见图I。其中I X TAE 电泳缓冲液40 mmol /T, Tris, 20 mmol/L 乙酸,2 mmol/L EDTA ;所述I. 2 %的琼脂糖凝胶0. 36 g琼脂糖，加入30 mL I X TAE加热溶解，待冷却以后加入2U L核酸染料Goldview I。6、柑橘溃疡病菌的模板DNA的PCR扩增及产物检测 (I)选择柑橘溃疡病菌的特异性引物对P I ( 5’TGCGGGCGTCCTCACAAAT 3’)和P 2(5’ C CCGCCTTAGCCTACACGAC 3’ )作为扩增引物，目的片段长度为373 bp。25 mL PCR 反应体系ddH20 18.85 uL,2. 5 uL 10 X Buffer本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.ー种柑橘溃疡病菌的DNA水浴沉淀提取方法，其特征在于包括以下步骤 (a)将新鲜菌体加入洗涤缓冲液充分混合，使细菌细胞沉淀，弃上清液； (b)往步骤(a)制得的沉淀中加入裂解缓冲液，振荡悬浮，并于65で水浴，完全反应； (c)加入65で预热的抽提缓冲液，充分混合，加入等体积饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液抽提，离心使变性的蛋白沉淀，取上清液； (d)按照体积比为1:2的比例往步骤(c)制得的上清液中加入无水こ醇，-20°C放置待充分反应后，再高速离心至沉淀完全去上清液，加入体积浓度为70 %的こ醇洗涤沉淀，晾干后加入灭菌ddH20溶解沉淀，-20°C保存备用。2.根据权利要求I所述的柑橘溃疡病菌的DNA水浴沉淀提取方法，其特征在于所述步骤(a)中，每O. 12 g样品中加入洗涤缓冲液I mL ;所述洗涤缓冲液组成为50 mmol/LTris, pH 7. 7 ；25 mmol/L EDTA ...

【专利技术属性】
技术研发人员：易龙，陶珍珍，卢占军，
申请(专利权)人：赣南师范学院，
类型：发明
国别省市：