一株海洋细菌Pseudoalteromonas sp SC127及其制备的石莼硫酸鼠李聚糖酶制造技术

本发明专利技术的目的是提供了一株海洋细菌Pseudoalteromonas sp SC127及其制备的石莼硫酸鼠李聚糖酶。该菌株保藏编号为CCTCC NO. M 2015422，其具有硫酸鼠李聚糖酶生产能力，可用于寡聚硫酸鼠李聚糖的制备。通过酶的分离纯化，SDS-PAGE确定该菌株产生的硫酸鼠李聚糖酶的分子量为110.6 kDa。利用本发明专利技术的菌株作为硫酸鼠李聚糖酶的生产菌株，具有营养要求简单、产酶活性高、稳定性好、生产周期短、成本低的特点，在工业生产中具有一定的应用价值，为低聚糖的活性研究和开发提供保证。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于海洋微生物
，具体涉及一株海洋细菌PseudoalteromonasspSC127及其制备的石莼硫酸鼠李聚糖酶。
技术介绍
硫酸鼠李聚糖是广泛存在于石莼、浒苔、礁膜等绿藻中的一种高分子量的硫酸杂多糖，主要由鼠李糖及鼠李糖硫酸酯组成，另外还含有葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、糖醛酸等。研究发现它具有多种生理活性，包括抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、降血糖血脂、免疫调节、抗氧化活性等功效，是一类具有重要生物活性的非常有药用价值的化合物。但因硫酸鼠李聚糖分子量巨大，分子量分布从几万到百万不等，严重影响了它的吸收效率；同时其具有一定的粘性，也大大阻碍了它作为药物的应用。目前，降解硫酸鼠李聚糖的方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降解法。较之化学降解法和物理降解法，酶解法具有降解特异性、选择性好，反应过程容易控制，易于得到所需分子量范围的低聚糖产品，产物含量高，功能性强等优势，是降解硫酸鼠李聚糖的最佳方法。据本专利技术人通过查阅资料、文献检索所知，国内外关于硫酸鼠李聚糖酶已有一些报道，产硫酸鼠李聚糖酶的菌种主要来源于交替单胞菌属（Alteromonassp.）、Catenovulum属海洋细菌及一些真菌。酶的分子量是酶重要的性质表征，它代表了不同酶蛋白的分子大小，也是描述酶学性质的重要指标。如CN104560774A公开了一种来源于Catenovulum属的Catenovulumsp.LP214生产浒苔多糖裂解酶制备硫酸鼠李聚糖镶嵌段寡糖，其酶分子量为75.5kDa；CN103451119A公开了一种来源于交替单胞菌属的AlteromonascdwellianaA321菌株生产浒苔多糖降解酶，其酶L1的分子量约为76.4kDa，酶L2的分子量约为100kDa左右；CN1189185公开了一种来源于青霉属的产硫酸鼠李聚糖酶菌株（保藏于CNCM保藏号1-1577和1-1578），该菌所产酶具有降解鼠李半乳糖醛酸聚糖的能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一株海洋细菌PseudoalteromonasspSC127及其制备的石莼硫酸鼠李聚糖酶，本专利技术提供的菌株来源于海洋假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas），能够生产硫酸鼠李聚糖酶，有效降解硫酸鼠李聚糖生成寡糖，克服了将硫酸鼠李聚糖应用在保健、医药、农业等方面的困难，对新型寡糖的开发、构效关系研究及应用开发都具有重要的现实意义。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一株海洋细菌PseudoalteromonasspSC127，该菌株于2015年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.M2015422。本专利技术还提供了所述的海洋细菌PseudoalteromonasspSC127产生的石莼硫酸鼠李聚糖酶，所述石莼硫酸鼠李聚糖酶通过以下制备方法制得：（1）发酵产酶：将所述菌株SC127接种于含有硫酸鼠李聚糖的培养基中，50～250r/min，15～32℃培养20-48h，获得种子培养液，将种子培养液接种于新鲜的发酵培养基得到发酵菌液；（2）粗酶制备：将所述发酵菌液冷冻离心，取上清液；向上清液中缓慢加入预冷丙酮，搅拌均匀，静止，冷冻离心，弃上清；沉淀部分加入蒸馏水复溶，使沉淀充分溶解，冷冻离心，去除不溶的杂蛋白，上清部分即为浓缩粗酶液；（3）酶的纯化：将浓缩粗酶液通过Q-SepharoseFastFlow阴离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析对酶进行分离纯化，最终获得纯化的石莼硫酸鼠李聚糖酶。所述石莼硫酸鼠李聚糖酶分子量为110.6kDa。所述步骤（3）中将浓缩粗酶液过滤后上样于Q-SepharoseFastFlow离子交换柱，洗脱液为含有NaCl的PBS缓冲液，进行梯度洗脱，流速为1mL/min，收集洗脱液，将有活性的蛋白合并，进行下一步纯化。离子交换柱纯化后的活性蛋白浓缩后上样于SephadexG-100凝胶柱，洗脱液为PBS缓冲液，收集洗脱液，将有活性的蛋白合并。本专利技术从海泥样品中筛选出一株高产石莼硫酸鼠李聚糖酶的菌株，依据形态学特征和16SrDNA序列分析，初步鉴定其属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)，命名为Pseudoalteromonassp.SC127。将该菌株接种到含硫酸鼠李聚糖的培养基中，50～250r/min，15～32℃培养20-48h，将发酵液4℃下8000rpm冷冻离心5min，即得含硫酸鼠李聚糖酶发酵菌液。向发酵菌液中加入1倍体积的无水乙醇或丙酮，4℃过夜，于4℃下10000r/min离心，用等体积的蒸馏水将沉淀复溶，得到粗酶液，进一步采用丙酮沉淀、Q-SepharoseFastFlow阴离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析对酶进行分离纯化，经SDS-PAGE检验，最终收集到的活力组分呈现单一条带，该酶的相对分子质量为110.6kDa。经查阅资料、检索文献可知，该石莼硫酸鼠李聚糖酶的分子量不同于以往的报道，且为首次发现假交替单胞菌属菌株具有产硫酸鼠李聚糖酶能力。本专利技术提供的具有硫酸鼠李聚糖酶生产能力的细菌，该菌株产酶活力高。1个酶活单位定义为35℃、pH7.0条件下，每分钟产生1微克还原糖需要的酶量。经测定，Pseudoalteromonassp.SC127发酵菌液酶活可达到3.5U/mL，具有在工业生产中的应用价值。附图说明图1Pseudoalteromonassp.SC127菌株所产硫酸鼠李聚糖酶的SDS-PAGE电泳结果。左边为标准蛋白分子量，右边为菌株Pseudoalteromonassp.SC127发酵并经纯化后的电泳纯度的硫酸鼠李聚糖酶蛋白条带，表示数量单位为：kDa。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。一、菌株Pseudoalteromonassp.SC127的筛选对海藻泥样品进行微生物富集、初筛、复筛，获得产酶菌。对产酶菌进行液体培养，从发酵菌液中提取胞外产物，获得硫酸鼠李聚糖酶。具体技术方案如下：1.富集培养：无菌条件下取适量绿藻样品，加入无菌海水捣碎，取样品2.5mL接入50mL富集培养基（硫酸鼠李聚糖0.3%，蛋白胨0.5%，硝酸钠0.4%，无水硫酸镁0.05%，磷酸氢二钾0.15%，陈海水配制，pH自然）进行培养，在25℃，150rpm的恒温培养摇床培养7天。培养结束后，取上述富集液5mL接入富集培养基重复富集两次。2.初筛：将富集培养液适当稀释后，涂布于选择性培养基（硫酸鼠本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株海洋细菌Pseudoalteromonas sp SC127，该菌株于2015 年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO. M 2015422。

【技术特征摘要】
1.一株海洋细菌PseudoalteromonasspSC127，该菌株于2015年7月2日保藏在中国
典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.M2015422。
2.权利要求1所述的海洋细菌PseudoalteromonasspSC127产生的石莼硫酸鼠李聚糖
酶，其特征在于所述石莼硫酸鼠李聚糖酶通过以下制备方法制得：
（1）发酵产酶：将所述菌株SC127接种于含有硫酸鼠李聚糖的培养基中，50～250r/
min，15～32℃培养20-48h，获得种子培养液，将种子培养液接种于新鲜的发酵培养基得到
发酵菌液；
（2）粗酶制备：将所述发酵菌液冷冻离心，取上清液；向上清液中缓慢加入预冷丙酮，搅
拌均匀，静止，冷冻离心，弃上清；沉淀部分加入蒸馏水复溶，使沉淀充分溶解，冷冻离心，去
除不溶的杂蛋白，上清部分即为浓缩粗酶液；
（3）酶的纯化：将浓缩粗酶液通过Q-SepharoseFastFlow阴离子交换层析和
Sephad...

【专利技术属性】
技术研发人员：江晓路，沈照鹏，
申请(专利权)人：青岛海洋生物医药研究院股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37