本发明专利技术公开了一种利用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法：用打孔器在普鲁士蓝琼脂平板上打出直径为4~10mm的小孔，然后将小孔中加入待测液，室温静置10~300min，待测液产生的过氧化氢在所述的小孔周围形成蓝色圈，测定蓝色圈的直径，根据过氧化氢与蓝色圈直径制作的标准直线来确定过氧化氢释放量，从而推论得L-氨基酸氧化酶活力；所述待测液以交替假单胞菌B3（Pseudoalteromonas?sp.B3）发酵培养获得的酶为酶源，以L-氨基酸为底物，25～50℃，pH为5～9条件下反应0.5～2h，获得的反应液即为待测液；本发明专利技术方法具有成本低，操作简单方便，适用性广，稳定性高等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及L-氨基酸氧化酶活力测试方法，特别涉及一种利用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法。
技术介绍
L-氛基酸氧化酶(L-amino acid oxidase,简称 LAA0,酶学编号为ECl. 4. 3. 2)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或单核苷酸(FMN)为辅基的黄素蛋白酶。此酶能够特异性催化L-氨基酸的氧化脱氨生成α -酮酸、氨和过氧化氢。因此，它能被应用于L-氨基酸定量分析、LD-氨基酸的拆分和α-酮酸的制备。近年来有文献报道了 LAAO本身具有抗菌、杀虫、抗病毒等生物活性，还具有与血小板相互作用、细胞毒性及诱导细胞凋亡的作用，其在生物医药领域具有极其广阔的应用前景。·LAAO被发现广泛存在于微生物、蛇毒、鱼的表皮粘液、老鼠、海兔子等多种生物体中。目前检测LAAO活性的常用方法有2种，即荧光法和分光光度法。这2种方法均是依据测定由LAAO催化底物所生成的H2O2变化量来实现的。荧光法是依据酶促反应产生的H2O2可使无荧光性的高香草酸等物质转变为有强烈荧光的物质，根据反应体系荧光值的变化来测定LAAO酶活。此方法虽然测定精确度、灵敏度都较高，但荧光寿命短，容易淬灭，操作时需避免长时间暴露于光和空气中，而且蛋白质中某些氨基酸对其干扰较大。分光光度法是依据酶促反应产生的H2O2可作用于色素原物质而使其在一定波长下产生吸光值，根据反应体系吸光值的变化来测定LAAO酶活。此方法对设备要求低，反应快，操作简单，重复性好，且价格便宜，具有明显的优势，因此分光光度法是目前测定LAAO活性的最常用方法° MacHeroux 等(MacHeroux P, Seth O, Bollschweiler C，et al. L-Amino acidoxidase from the Malayan pit viper Calloselasma rhodostoma. Comparative sequenceanalysis and charaterization of active and inactive forms ofthe enzyme. Eur JBiochem, 2001, 268:1679-1686.)以邻联茴香胺(ODA)为偶联探针，用分光光度法测定不同蛇毒LAAO的活性。结果表明，测定方法具有较好的稳定性。陈洲等(陈洲，黄剑钧，薛玲，等.眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶活性检测方法的优化.海峡药学，2009，21 (5) :29-31.)采用邻联茴香胺、邻苯二胺(OPD)和3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)三种供氢体测定LAAO的活性并比较其灵敏度和重复性，结果表明邻苯二胺方法测定LAAO酶活性具有较好的灵敏度和稳定性。以上的这些方法主要是用来定性地检测LAA0，而建立一种既简单、经济、稳定和灵敏，又能定性并定量检测LAAO活力的方法，将具有极重要的研究和应用价值。目前，定性及定量检测LAAO的方法主要是商品化的H2O2检测试剂盒,如美国Invitrogen公司的Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit。专利技术专利(余志良、乔华、裘娟萍.交替假单胞菌B3及其在生物氧化L-氨基酸中的应用.申请号201110336029. 3 ;申请日期2011-10-28.)也用 Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit 试剂盒筛选到一株产LAAO的交替假单胞菌B3 (菌种保藏号为CGMCC NO. 5353)。虽然，该试剂盒比较灵敏、稳定，被广泛使用，但是，其对设备要求高，操作复杂，价格极其昂贵(每个反应大约要几十元人民币)。2OO7 年，Saito 等(Saito M, et al. A Noval Agar Medium to Detect HydrogenPeroxide-Producing Bacteria Based on the Prussion Blue-Forming Reaction.Microbiol Immunol, 2007, 51(9) :889-892.)创建了一种新的简易的检测H2O2的方法来运用于检测LAA0,即普鲁士蓝琼脂平板法(Prussian Blue Agar),该方法是基于Fe3+和铁氰化钾混合液与H2O2通过氧化还原反应产生蓝色沉淀的原理检测LAA0，能够产生H2O2的菌株培养在含有该混合液的培养基上能产生蓝色菌落，不能产生H2O2的菌株则不会产生蓝色菌落而只表现其原本的形态特征，通过菌落颜色的改变可以判断出菌株是否能够产生LAA0，而且该Fe3+和铁氰化钾混合液对于培养基的种类没有严格的限制与要求，可以与所需的培养基进行混合培养，具有广泛的适用性，而且，该方法极其方便、简单和经济。Saito等只建立了一种定性分析LAAO的方法，如何将其发展成为一种定量的LAAO活力检测方法，显得极为重要。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法，以及所述方法的PH适用性，该方法具有成本低，操作简单方便，适用性广，稳定性高等特点。本专利技术采用的技术方案是用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法为(I)普鲁士蓝琼脂平板的制备将l(T30g/L氯化铁水溶液与l(T30g/L铁氰化钾水溶液以体积比O. 2飞I混合制成混合液，然后将混合液与丽琼脂液以体积比1:5 20混合摇匀，在115°C下灭菌30min,倒平板，制成所述普鲁士蓝琼脂平板；所述丽琼脂液终浓度组成为酵母膏O 10g/L、蛋白胨2 20g/L、琼脂15 30g/L，pH 5 9，溶剂为水；(2) L-氨基酸氧化酶活力的测定取步骤(I)制得的普鲁士蓝琼脂平板，用打孔器在所述普鲁士蓝琼脂平板上打出直径为riOmm的小孔，然后将小孔中加入待测液，室温静置l(T300min，待测液产生的过氧化氢在所述的小孔周围形成蓝色圈，测定蓝色圈的直径，根据过氧化氢与蓝色圈直径标准直线来确定过氧化氢释放量，从而推论得L-氨基酸氧化酶活力；所述的过氧化氢与蓝色圈直径的标准直线是用步骤(2)同样的普鲁士蓝琼脂平板以梯度浓度的标准过氧化氢为测试样品做与待测液平行试验取得的数据得到的标准浓度的过氧化氢与蓝色圈直径线性关系图；所述待测液的制备方法为以交替假单胞菌B3 (Pseudoalteromonas sp. B3)发酵培养获得的酶为酶源，以待测L-氨基酸为底物，25 50°C，pH 5 9条件下反应O. 5 2h，获得的反应液即为待测液；所述酶来自于交替假单胞菌B3发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心弃去沉淀后获得的上清液，所述L-氨基酸初始底物浓度为2 20mmol/L，所述上清液用量以含湿菌体发酵液中湿菌体质量计为O. 5 IOmg湿菌体/mmol底物，所述含湿菌体发酵液是指离心前的含湿菌体发酵液；所述L-氨基酸氧化酶活力的定义为30°C下，ImL酶液作用底物浓度为5mmol/L的氨基酸Ih后释放出lmmol/L过氧化氢即为I个酶活单位(U)。进一步，所述氯化铁水溶液优选为15 25g/L，更优选为20g/L ;铁氰化钾水溶液的质量浓度优选为15 25g/本文档来自技高网...
【技术保护点】
用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L？氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述方法为：（1）普鲁士蓝琼脂平板的制备：将10~30g/L氯化铁水溶液与10~30g/L铁氰化钾水溶液以体积比0.2~6:1混合制成混合液，然后将混合液与MM琼脂液以体积比1:5~20混合摇匀，在115℃下灭菌30min，倒平板，制成所述普鲁士蓝琼脂平板；所述MM琼脂液终浓度组成为：酵母膏0～10g/L、蛋白胨2～20g/L、琼脂15～30g/L，pH？5～9，溶剂为水；（2）L？氨基酸氧化酶活力的测定：取步骤(1)制得的普鲁士蓝琼脂平板，用打孔器在所述普鲁士蓝琼脂平板上打出直径为4~10mm的小孔，然后将小孔中加入待测液，室温静置10~300min，待测液产生的过氧化氢在所述的小孔周围形成蓝色圈，测定蓝色圈的直径，根据过氧化氢与蓝色圈直径标准直线来确定过氧化氢释放量，从而推论得L？氨基酸氧化酶活力；所述的过氧化氢与蓝色圈直径的标准直线是以所取用步骤(2)同样的普鲁士蓝琼脂平板以梯度浓度的标准过氧化氢为测试样品做与待测液平行试验取得的数据得到的标准浓度的过氧化氢与蓝色圈直径线性关系图；所述待测液的制备方法为：以交替假单胞菌B3（Pseudoalteromonas？sp.B3）发酵培养获得的酶为酶源，以待测L？氨基酸为底物，25～50℃，pH？5～9条件下反应0.5～2h，获得的反应液即为待测液；所述酶来自于交替假单胞菌B3发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心弃去沉淀后获得的上清液，所述L？氨基酸初始底物浓度为2～20mmol/L，所述上清液用量以含湿菌体发酵液中湿菌体质量计为0.5～10mg湿菌体/mmol底物；所述L？氨基酸氧化酶活力的定义为：30℃下，1mL酶液作用底物浓度为5mmol/L的L？氨基酸1h后释放出1mmol/L过氧化氢即为1个酶活单位（U）。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：余志良，周宁，裘娟萍，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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