本发明专利技术涉及几丁质结合蛋白CBP58及其编码基因和应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术首次从菌株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)中克隆出几丁质蛋白CBP58的编码基因，通过构建原核表达载体、咪唑洗脱获得了具有高活性的表达产物，制备过程简单，为几丁质蛋白CBP58的后续研究提供了简便方法，而且生产成本低、易保存；该几丁质蛋白CBP58具有几丁质结合功能，用于纯化和辅助鉴定几丁质；对于黑曲霉(Aspergillus niger)和苹果树腐烂病(Cytospora mandshurica Miura)具有良好的抑制效果，具有潜在的生物防治功能，为农业领域抗真菌药物研发的提供新的研究方向，具有广阔应用价值，将产生巨大工业效益和经济价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种几丁质结合蛋白CBP58及其编码基 因和应用。
技术介绍
几丁质（chitin)，俗称甲壳素、甲壳质，由N-乙酰葡萄糖胺单体以β-1，4_糖苷键 连接起来的直链多聚物，是自然界中含量最丰富，海洋环境中仅次于纤维素的第二大可再 生资源。几丁质广泛存在于甲壳纲动物虾蟹、昆虫的甲壳，以及真菌（酵母，霉菌）、藻类、植 物的细胞壁中。据估测，海洋环境每年超过IO n吨几丁质形成，其降解主要是通过产几丁质 酶的微生物完成。 微生物几丁质降解系统主要由内切几丁质酶（chitinase，EC 3. 2. 1. 14)、外切几 丁质酶（chitinase，EC 3·2· 1. 14)、β_Ν_ 乙酰己糖胺酶（β-Ν-acetylhexosaminidase， EC 3.2.1.52)与几丁质结合蛋白（chitin-binding protein, CBP)等组成。内切几丁质酶 在高聚几丁质链内随机切割生成几丁质寡糖（chitooligosaccharides, (GlcNAc)n, n>2); 外切几丁质酶有两种，分别从高聚几丁质链的还原端和非还原端依次切割下（GlcNAc) 2; β-N-乙酰己糖胺酶将从非还原端将几丁质寡糖切割成为GlcNAc。其中几丁质结合蛋白 (chitin-binding protein, CBP)，起到分散几丁质糖链束的作用，对于不溶多糖降解起着 决定性的作用。几丁质结合蛋白是一类能与几丁质特异结合的蛋白质，广泛存在于各种微 生物、动物和植物中。但是目前人们对于假交替单胞菌及其几丁质酶蛋白的认识还有限，现 有的一些几丁质蛋白的生物活性及其表达仍不理想，还有一些几丁质蛋白对活性存在条件 苛刻，制备、保存成本高，这些因素对于几丁质蛋白的应用造成限制。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种具有高效抗病原真菌活性且制备方法简单、 易保存的几丁质结合蛋白CBP58及其编码基因和应用。 为解决上述问题，本专利技术采用的构思是：本专利技术以假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas sp.DL-6)菌株为研宄对象，克隆和表达分析了几丁质蛋白的基因， 为农业领域抗真菌药物研发的提供新的研宄方向，具有广阔的应用价值。假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas sp.DL-6)菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2013年 12月13日，其保藏编号为CGMCC No. 8580。 本专利技术的技术方案如下：一种几丁质结合蛋白CBP58,具有如SEQ ID No. 1所示的 核苷酸序列。 -种如权利要求1所述的几丁质结合蛋白CBP58的制备方法，以假交替单胞菌株 (Pseudoalteromonas sp. DL-6)基因组 DNA 为模板，以 CBP58-F 和 CBP58-R 引物对进行 PCR 扩增；所述引物为：上游引物 CBP58-F:5' -GGAATTCCATATGCATGGTTATATGGATAGCCCTAAAG-3' 下游引物 CBP58-R: 5 ' -CCGCTCGAGCAGTGTGGTCCATACATCGGCTTG-3 '。 进一步的，上述几丁质蛋白CBP58的编码基因其氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示， 由531个氨基酸组成。 本专利技术的另一个目的是提供上述几丁质结合蛋白CBP58的表达与纯化方法，包括 以下步骤： (1)碱基序列扩增：以PCR方法扩增如SEQ ID No. 1所示的DNA序列； (2)构建大肠杆菌克隆载体pMD19-T-CBP58 :将PCR扩增的DNA序列和pMD19-T simple载体用同样的限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用 T4DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到克隆载体pMD19-T-CBP58 ; (3)构建大肠杆菌重组表达载体：将克隆载体pMD19-T-CBP58质粒转化至E. coli DH5 α，得到阳性转化子，用限制性内切酶NdeI和XhoI将CBP58基因片段从pMD19-T-CBP58 质粒上切下，连接到pET-23b表达载体上，转化至Ε. coli BL21 (DE3)，通过菌落PCR、酶切筛 选鉴定阳性转化子克隆，得到重组表达载体pET23b-CBP58 ; (4)构建大肠杆菌重组表达菌株BL21 (DE3) -pET23b-CBP58 :将重组表达载体 pET23b-CBP58质粒转化至E. coli BL21 (DE3)，挑选阳性转化子克隆，得到重组表达菌株 BL21(DE3)-pET23b-CBP58 ； (5)体外诱导表达：将重组表达菌株BL21 (DE3)-pET23b-CBP58接入含氨苄的LB 培养基中，于37°C过夜培养14h后，按1 %的接种量接种到含氨苄的LB培养基中，当OD6tltol 达到0. 6~0. 8,加入终浓度为0. 2mM的IPTG，于30°C，IOOrpm低温诱导6h ; (6)几丁质结合蛋白CBP58的纯化：体外诱导表达结束后，于4°C，5, OOOXg离心 5min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体三次，再用PBS缓冲液重悬菌体；之后置于冰上超声 破碎三次，每次30s，每次间隔lmin，最后于4°C，8, 000 X g离心20min，收集上清液，即为粗 蛋白，粗蛋白用Ni2+-NTA柱进行亲和层析纯化，得到几丁质结合蛋白CBP58。 本专利技术还请求保护上述几丁质结合蛋白CBP58的新用途。 所述的几丁质结合蛋白CBP58在几丁质结合中的应用。 所述的几丁质结合蛋白CBP58在抑制黑曲霉（Aspergillus niger)和苹果树腐烂 病（Cytospora mandshurica Miura)真菌中的应用。 本专利技术的有益效果是： 1、本专利技术首次从菌株假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp. DL-6)中克隆出几丁 质蛋白CBP58的编码基因，通过构建原核表达载体获得了具有高活性的表达产物，制备过 程简单，为几丁质蛋白CBP58的后续研宄提供了简便方法，而且生产成本低、易保存； 2、本专利技术提供的几丁质蛋白CBP58具有与几丁质结合的功能，用于纯化和辅助鉴 定几丁质； 3、本专利技术中几丁质蛋白CBP58对于黑曲霉（Aspergillus niger)和苹果树腐烂病 (Cytospora mandshurica Miura)具有良好的抑制效果，具有潜在的生物防治功能，为农业 领域抗真菌药物研发的提供新的研宄方向，具有广阔的应用价值，将产生巨大的工业效益 和经济价值。【附图说明】 图I. CBP58基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果； 图2. CBP58蛋白的SDS-PGAE检测结果； 图3. CBP58蛋白的纯化； 图4.酶活标准曲线和标准曲线方程； 图5.扫描电子显微镜观察CBP58蛋白结合α 当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种几丁质结合蛋白CBP58，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王晓辉，迟乃玉，张庆芳，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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