一种葡萄座腔菌的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种葡萄座腔菌的检测方法，尤其是指葡萄座腔菌的三重实时荧光PCR检测方法，属于检验检疫技术领域。本发明专利技术设计了三组葡萄座腔菌特异性引物和探针，并对反应体系进行了优化，建立了三重实时荧光定量PCR检测方法，能够同时检测鉴定多种病原真菌以及确定复合侵染病原。本发明专利技术将纳米磁微粒运用于真菌核酸提取中，使得真菌核酸提取更加操作简单、高效，同时与实时荧光检测技术相结合，可用于田间病害发生监测及病原菌快速、高通量的检测鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种葡萄座腔菌的检测方法，尤其是指葡萄座腔菌的三重实时荧光PCR检测方法，属于检验检疫

技术介绍
葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)真菌寄主范围广泛，不仅存在于土壤中也作为内生真菌寄生于健康植株，遇到适宜环境条件便侵染植株引发病害，导致植株发生枯萎、腐烂和溃疡等病害。苹果壳色单隔孢溃疡病菌(Botryosphaeria stevensii以及Botryosphaeria obtusa，Botryosphaeria dothidea)是我国进境检疫性有害生物，产生毒素严重危害苹果、梨、葡萄等多种果树，对苹果产业造成巨大的经济损失。对病原菌的准确、快速检测鉴定是研究病害发生、发展及群体结构的重要基础，然而利用传统的病原菌分离方法对田间病样进行分离鉴定，需要消耗大量时间，同时要求鉴定人员具备专业的病原菌鉴定技能。葡萄座腔菌可用于分类的有性态特征较少，且很难用培养基培养，因此目前鉴定葡萄座腔菌主要根据其无性态特征来进行鉴定，但是该属真菌无性态特征不稳定，容易受环境条件的影响。因此，开发一种对该类真菌快速、准确的检测方法，对田间病害的发生发展进行监测具有重要的意义。中国专利申请201210229358、专利技术名称“葡萄溃疡病菌快速检测引物及其应用”公开了一种利用PCR技术检测葡萄溃疡病菌的技术，其中使用了特异性引物组，能够对多种葡萄溃疡病菌以及葡萄穗轴褐枯病菌、葡萄枝枯病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌、葡萄蔓枯病菌具有良好的检测效果。冯小慧等(杨树溃疡病病原的多重PCR检测技术，2012)公开了利用多重PCR检测技术检测4种杨树溃疡病病原菌株(Botryosphaeria dothidea，Valsa sordida，Leucostoma sp.，Valsa ambiens)取得了良好的检测效果。然而，该方法仍然使用传统的PCR技术，需要对PCR扩增结果进行分离鉴定，因此在设计引物时需要考虑扩增产物的区分度，同时不能适用本专利技术待测的三种病原菌，从而制约了相关应用。实时荧光PCR技术是在常规PCR基础上发展起来的一种核酸定量技术，利用荧光信号的积累实现对整个PCR过程的实时监控。整个反应在一个密闭的状态下进行，不需要进行后续的试验就能够获得结果，有效减少了样品间的交叉污染，灵敏度高，目前正广泛用于病原菌及病毒的检测鉴定中。中国专利申请200910236112、专利技术名称“检测葡萄苦腐病菌的引物和探针及其检测方法”和中国专利申请201310631946、专利技术名称“葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测试剂及检测方法”均公开了荧光定量PCR特异性检测葡萄疫病的技术，其中通过设计高特异性引物和高灵敏度荧光探针的组合，能够获得良好的检测效果。黄海泉(“实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展”，《湖北农业科学》，2012年)报道了实时荧光定量PCR技术已经广泛用于真菌引起的植物病虫害检测中，但该文指出目前仍然没有合适的实时荧光PCR技术来检测三种葡萄座腔菌(B.stevensii，B.obtusa，B.dothidea)。尽管多重荧光PCR法具有常规多重PCR不具有的优点，但其使用的荧光基团数量有限，淬灭染料或基团也可发生荧光，从而造成一定干扰。此外，影响多重PCR最重要的因素是多重引物之间的相容性。理想状态下是所有引物对有相同的扩增效率和解链温度，这样在同一温度下互补链才能分离，扩增才能同时进行，而解决这一问题最主要的是引物退火温度要相同或尽可能相近。因此，退火温度和时间以及延伸时间对扩增影响较明显，而循环次数影响较小。综合所述，随着引物对增加，各引物对的解链温度差过大，以及选用不合适的荧光探针和淬灭基团，多重PCR难度也会增加，从而影响了多重荧光PCR的检测准确度，由于以上三种葡萄座腔菌严重危害我国苹果产业的生产，因此目前急需一种实时荧光PCR技术来有效检测以上三种葡萄座腔菌。
技术实现思路
本专利技术原理在于选择特殊设计的引物，并放弃使用相同类型的荧光基团，而设计不同类型的荧光基团来修饰探针，从而为多重实时PCR检测葡萄座腔菌提供新的检测方法。因此，本专利技术要解决的技术问题是提供一种快速、准确、高通量三重荧光定量PCR检测三种葡萄座腔菌(B.stevensii，B.obtusa，B.dothidea)的技术。因此，本专利技术第一个目的在于提供一种三重荧光定量PCR的检测组合物，包括：B.stevensii引物Bst-F:TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAG(SEQ ID No.1)B.stevensii引物Bst-R：CAAGTGCGGCCAGTTTGC(SEQ ID No.2)B.stevensii探针Bst-T：TGCGCTTATCTGCCGCCGTG(SEQ ID No.3)B.obtusa引物Bob-F：TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAG(SEQ ID No.1)B.obtusa引物Bob-R：CAAGTGCGGCCAGTTTGC(SEQ ID No.2)B.obtusa探针Bob-T：ACAGCCCACCTTATCGCTCGGTGAG(SEQ ID No.4)B.dothidea引物Bod-F：TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAG(SEQ ID No.1)B.dothidea引物Bod-R：GGAGATTTTGCCGAAGACCA(SEQ ID No.5)B.dothidea探针Bod-T：ACATTTTCTGTGCCTGCACGTGTGCTG(SEQ ID No.6)。在一个实施方案中，三条探针标记的荧光基团分别为FAM(适用于探针Bst-T)、NED(适用于探针Bob-T)、JOE(适用于探针Bod-T)，对应的淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ1。在一个具体实施方案中，所述B.stevensii探针Bst-T，5’端标记的荧光基团及3’端淬灭基团为FAM、BHQ1；B.obtusa探针Bob-T标记的荧光基团及淬灭基团为NED、BHQ2；B.dothidea探针Bod-T标记的荧光基团及淬灭基团为JOE、BHQ1。本专利技术第二个目的在于提供利用上述检测组合物，用于三重荧光定量PCR检测三种葡萄座腔菌的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：(1)采集待测样本；(2)提取样本基因组DNA；(3)用多重实时荧光PCR法检测；其中，所述三种葡萄座腔菌选自B.stevensii，B.obtusa本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三重荧光定量PCR的检测组合物，包括：B.stevensii引物Bst‑F:TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAG(SEQ ID No.1)B.stevensii引物Bst‑R：CAAGTGCGGCCAGTTTGC(SEQ ID No.2)B.stevensii探针Bst‑T：TGCGCTTATCTGCCGCCGTG(SEQ ID No.3)B.obtusa引物Bob‑F：TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAG(SEQ ID No.1)B.obtusa引物Bob‑R：CAAGTGCGGCCAGTTTGC(SEQ ID No.2)B.obtusa探针Bob‑T：ACAGCCCACCTTATCGCTCGGTGAG(SEQ ID No.4)B.dothidea引物Bod‑F：TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAG(SEQ ID No.1)B.dothidea引物Bod‑R：GGAGATTTTGCCGAAGACCA(SEQ ID No.5)B.dothidea探针Bod‑T：ACATTTTCTGTGCCTGCACGTGTGCTG(SEQ ID No.6)。...

【技术特征摘要】
1.一种三重荧光定量PCR的检测组合物，包括：
B.stevensii引物Bst-F:TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAG(SEQ ID No.1)
B.stevensii引物Bst-R：CAAGTGCGGCCAGTTTGC(SEQ ID No.2)
B.stevensii探针Bst-T：TGCGCTTATCTGCCGCCGTG(SEQ ID No.3)
B.obtusa引物Bob-F：TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAG(SEQ ID No.1)
B.obtusa引物Bob-R：CAAGTGCGGCCAGTTTGC(SEQ ID No.2)
B.obtusa探针Bob-T：ACAGCCCACCTTATCGCTCGGTGAG(SEQ ID No.4)
B.dothidea引物Bod-F：TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAG(SEQ ID No.1)
B.dothidea引物Bod-R：GGAGATTTTGCCGAAGACCA(SEQ ID No.5)
B.dothidea探针Bod-T：ACATTTTCTGTGCCTGCACGTGTGCTG(SEQ ID No.6)。
2.权利要求1的检测组合物，其中三条探针标记的荧光基团分别为FAM、NED、
JOE，对应的淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ1。
3.权利要求1或2所述的检测组合物，用于三重荧光定量PCR检测三种葡萄座
腔菌的方法。
4.权利要求3的方法，包括以下步骤：
(1)采集待测样本；
(2)提取样本基因组DNA；
(3)用多重实时荧光PCR法检测；
其中，所述三种葡萄座腔菌选自B.stevensii，B.obtusa，B.dothidea。
5.权利要求4的方法，其中所述步骤(2)提取样本基因组DNA，是采用的是
磁珠提取法。主要步骤如下：取研磨液放置于1.5mL离心管中；向离心管中加入
600μL裂解液，涡旋震荡混匀15s，室温静置10min，12000rpm离心2min；取
200μL上清于新的离心管中，加入200μL磁珠，震荡混匀，静置10min，收集
磁珠，弃上清；加入500μL洗涤液，弃废液收集磁珠；加入500μL无水乙醇洗

【专利技术属性】
技术研发人员：高文娜，况卫刚，郑春生，骆卫峰，张百怡，
申请(专利权)人：向华，
类型：发明
国别省市：湖南;43