本发明专利技术公开了一种建鲤管家基因18sRNA基因部分序列克隆方法及其real time PCR方法，通过对建鲤血液基因组DNA提取，设计引物、PCR扩增，产物纯化，转入T载体，转化入感受态细胞，筛选蓝白斑，质粒测序，设计的引物序列正向序列如SEQIDNO.1所示，反向序列如SEQIDNO.2所示；克隆得到的建鲤18sRNA基因部分序列为SEQIDNO.3所示；然后设计实时定量PCR（real time PCR）特异引物，优化扩增反应条件，从而提高扩增效率。本发明专利技术可为18sRNA作为管家基因，在利用real time PCR对建鲤功能基因的研究中提供有用的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种建鲤管家基因18sRNA基因部分序列克隆方法及其real time PCR方法。
技术介绍
在实时定量PCR (real time PCR)中，目标基因的相对表达量是通过管家基因表达量的均一化来确定。理想的管家基因应该是它的表达量不受实验条件影响，而且在各个组织中表达量恒定。大量的研究表明，目前还没有哪个管家基因符合这一条件，最好的管家基因就是其表达量在自己所研究的样品中变化量最小。18S rRNA 为核糖体rRNA，由45S rRNA加工而成，经核孔入胞质形成小亚基，参与蛋白质的合成。该基因在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的表达量一般是恒定的，故被广泛用作real time PCR中的管家基因。 在用Trizol提取的RNA样品中，不可避免的会有少量的DNA残留，通过DNAse酶处理去除DNA，反转录后，real time PCR扩增的模板仅为cDNA。另外再设计特异的引物，优化反应条件，达到理想的扩增效率，为后续的建鲤功能基因研究提供参考。 建鲤(Cyprinuscarpio var. jian)是本中心培育出的遗传性状稳定的鲤鱼新品种，具有生长快、体型佳、肉质好等优良的经济性状，已遍及我国27个省。但是目前还没有针对建鲤通过研究18sRNA作为管家基因，并利用real time PCR对建鲤功能基因进行研究。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术目的之一在于克隆出建鲤18sRNA基因的部分序列；本专利技术目的之二在于基于获得的序列，设计一对特异的real time PCR引物，建立基于SYBR Green I染料技术的建鲤18sRNA real time PCR方法，从而为18sRNA作为管家基因，在利用real time PCR对建鲤功能基因的研究中提供有用的方法。 技术方案： 本专利技术是通过以下技术手段实现的： 一种建鲤18sRNA基因的部分序列的克隆方法，按照以下步骤进行：建鲤血液基因组DNA提取，设计引物、PCR扩增，产物纯化，转入T载体，转化入感受态细胞，筛选蓝白斑，质粒测序，其中所设计的引物序列如下，其中正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示；克隆得到的建鲤18sRNA基因部分序列为SEQ ID NO.3所示。 所述的建鲤18sRNA基因的部分序列的克隆方法，PCR扩增的反应条件为：95℃ 3min；30循环，每个循环的条件可以为 94℃、15s，58℃、20s，72℃、30s，循环完以后72℃延长6min；4℃度保存。 一种real time PCR扩增以上所述建鲤18sRNA基因部分序列的方法，按以下步骤实现：抽提总RNA，反转录，然后以反转录产物为模板进行real time PCR，荧光染料为SYBR Green I，其中real time PCR中的建鲤特异引物序列中正向序列如SEQ ID NO.4所示，反向序列如SEQ ID NO.5所示。 以上所述的real time PCR扩增所述建鲤18sRNA基因部分序列的方法，其中所述real time PCR扩增的反应条件可以为：94℃ 3min，40个循环 每个循环条件为94℃、5s，62℃、20s，最后72℃3min，4℃保存。 有益效果 本专利技术通过克隆建鲤18sRNA的部分序列，然后设计特异的real time PCR引物，优化扩增反应条件，提高了扩增效率。这样，可为18sRNA作为管家基因，在利用real time PCR对建鲤功能基因的研究中提供有用的方法。 附图说明 图1为实施例1目的基因鉴定电泳图，其中M为marker，1为目的条带。 图2为18sRNA溶解曲线图； 图3为18sRNA标准曲线图。 具体实施方式： 实施例1 建鲤18sRNA基因的部分序列的扩增 建鲤来自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地，根据GenBank上公布的斑马鱼18sRNA基因的DNA序列设计一对引物，引物序列见表1。 表1 扩增建鲤18sRNA的引物 PCR是在含有50ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl（pH8.0）、2mmol/L MgCl2，200umol/L dNTPs、10μmol/L引物和0.5U Taq DNA聚合酶的25μl反应体系中进行、反应条件是95℃ 3min；30循环 (94℃ 15s、58℃ 20s、72℃ 30s)，72℃延长6min；4℃度保存。扩增的PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体，转化到DH5α感受态细胞中，经蓝白斑筛选，挑选阳性质粒，经琼脂糖凝胶电泳鉴定（图1）得到了所需目的基因，然后送到上海博尚生物技术有限公司测序。DNA序列用Blast软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行分析。建鲤18sRNA基因的部分序列如下所示： GACTCCGGTTCTATTTTGTGGGTTTCTGGAACCCGGGGCCATGATTAAGAGGGACGGCCGGGGGCATTCGTATTGCGCCGCTAGAGGTGAAATTCTTGGACCGGCGCAAGACGGACGAAAGCGAAAGCATTTGCCAAGAATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCGGAGGTTCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTTCCGACCGTAAACGATGCCGACCCGCGATCCGGCGGCGTTATTCCCATGACCCGCCGGGCAGCGTGTGGGAAACCACGAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTTGCAAAGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAACCTCACCCGGCCCGGACACGGAAAGGATTGACAGATTGATAGCT （SEQ ID NO.3） 其中下划线部分为real time PCR引物。 实验例2 建立基于SYBR Green I染料技术的建鲤18sRNA real time PCR方法 取建鲤成鱼肝脏约50mg，参照Takara公司RNA提取说明书，用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种建鲤18sRNA基因的部分序列的克隆方法，按照以下步骤进行：建鲤血液基因组DNA提取，设计引物、PCR扩增，产物纯化，转入T载体，转化入感受态细胞，筛选蓝白斑，质粒测序，其特征在于，所设计的引物序列如下，其中正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示；克隆得到的建鲤18sRNA基因部分序列为SEQ ID NO.3所示。
【技术特征摘要】
1.一种建鲤18sRNA基因的部分序列的克隆方法，按照以下步骤进行：建鲤血液基因组DNA提取，设计引物、PCR扩增，产物纯化，转入T载体，转化入感受态细胞，筛选蓝白斑，质粒测序，其特征在于，所设计的引物序列如下，其中正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示；克隆得到的建鲤18sRNA基因部分序列为SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的建鲤18sRNA基因的部分序列的克隆方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95℃ 3min；30循环，每个循环的条件为 94℃、15s，58℃、20s，72℃、30s，循环完以后72℃延长6min；4℃度保存。
3.一种real ...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐永凯，李红霞，李建林，俞菊华，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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