一种从绒山羊次级毛囊组织中提取总RNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种从绒山羊次级毛囊组织中提取高质量总RNA的方法，涉及分子生物学领域。主要提取步骤包括：采集、保存和运输毛囊组织，分离次级毛囊组织，提取次级毛囊组织总RNA，检测总RNA样品质量。本发明专利技术不仅操作简便，而且稳定性好，适用于普通实验室操作。本发明专利技术提取的次级毛囊组织总RNA纯度高、完整性好，可进一步用于cDNA制备、目的基因克隆、实时荧光定量PCR检测以及高通量测序等相关领域的科研工作。本发明专利技术的方法也适用于从其他动物的毛囊组织中提取总RNA。

【技术实现步骤摘要】
一种从绒山羊次级毛囊组织中提取总RNA的方法
本专利技术涉及动物分子生物学领域，具体是一种从绒山羊次级毛囊组织中提取总RNA的方法。
技术介绍
山羊绒是绒山羊的主要产品，是一种珍贵的纺织原料，具有极高的经济价值。绒毛是绒山羊皮肤的衍生物，初级毛囊生长粗毛，次级毛囊生长绒毛。绒山羊次级毛囊是一个精确的可再生器官，其周期性变化不仅控制着绒毛的生长发育，而且与产绒量、绒毛品质都紧密相关。次级毛囊的周期性变化过程是一个分子调控的过程，通过一系列信号通路和基因的相互作用来实现。在绒山羊次级毛囊周期性生长发育的分子调控机理方面，重点围绕绒山羊次级毛囊生长发育相关基因的筛选与鉴定、基因的克隆与表达模式分析以及寻找相关的调控因子，而开展这些研究工作的一个重要基础就是提取高质量的总RNA样品。绒山羊初级毛囊直径约为34-57微米，次级毛囊直径约为12-18微米。由于次级毛囊十分微小，分离过程较为困难，导致其总RNA提取不易。目前，在实验材料的选择上，绝大多数研究都是将绒山羊皮肤组织作为整体研究对象，提取其总RNA，没有直接分离次级毛囊提取总RNA。这样往往使得研究的目标人为扩大、工作量大幅度增加，给研究工作增添了许多不确定因素。此外，虽然也有从绒山羊离体皮肤组织块中分离次级毛囊并提取RNA的报道，但这些离体较长时间的次级毛囊肯定会引起RNA降解，导致实验结果的可靠性大大降低。一般的组织总RNA提取采用液氮研磨与TRIzoI试剂相结合的方式均可实现。然而，由于绒山羊次级毛囊组织微小，使用液氮冷冻后漂浮在液氮表面而研磨困难，并且次级毛囊组织RNA含量相对较低，采用这种方法提取的RNA产量和质量无法得到保证。特别是在野外条件下，携带液氮罐保存、运输毛囊组织样本也会受到一定的限制，给采样工作带来很大麻烦。因此，有必要发展一种能够直接从绒山羊次级毛囊组织中提取总RNA的有效方法，以满足基因克隆、基因表达、基因功能分析等研究的需要。本专利技术正是为了解决上述采样、保存、运输、提取等一系列难题而提供了一种从绒山羊次级毛囊组织中提取总RNA的方法。
技术实现思路
专利技术目的:针对上述现有技术存在的问题和不足，本专利技术的目的是提供了一种从绒山羊次级毛囊组织中提取总RNA的方法。技术方案:为了解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案如下:一种从绒山羊次级毛囊组织中提取总RNA的方法，包括以下步骤:I)采集、保存和运输毛囊组织:采集羊毛和羊绒混合物，经RNAlater保存液处理并低温保存以样品满足长途运输的需要；2)分离次级毛囊组织:在RNAlater保存液中从羊毛和羊绒混合物中分离出羊绒，在距离羊绒根部毛囊泡Icm处剪断，收集所有带有完整毛囊泡的羊绒根部，即分离得到次级毛囊组织；3)提取次级毛囊组织总RNA ；4)检测总RNA样品质量。上述步骤3)具体包括以下步骤:I)将分离的次级毛囊组织迅速转移到裂解液中，用研磨杵研磨裂解液中的次级毛囊组织，充分研磨以破碎组织得到混合液，研磨时间为5-10min，小心用尖头镊子剔除绒干；因毛囊是依附在绒干上的，研磨后组织脱落，需要剔除绒干。2)用移液器将研磨过的混合液转移到指形管中，1000Orpm离心3_5min，小心将上清液转移到指形管中；3)向上清液中加入等体积的70%乙醇溶液并混匀，混匀后的溶液转移到硅胶膜吸附柱中，放入指形管后盖上管盖，1000Orpm离心2_3min,弃去废液后再将吸附柱放入到一新的指形管中；4)向步骤3)处理后得到的吸附柱中加入500 μ L去除蛋白质溶液，1000Orpm离心2-3min,弃去废液后再将吸附柱放入到一新的指形管中；5)向步骤4 )处理后得到的吸附柱中加入lU/yL DNase Ι100μΙ，室温静置15_20min ；6)向步骤5)处理后得到的吸附柱中加入500 μ L漂洗液，室温静置3_5min后1000Orpm离心2_3min，弃去废液后再将吸附柱放入到一新的指形管中；重复漂洗操作两次；7)将步骤6)处理后得到的吸附柱在室温条件下静置5-10min，充分挥发掉吸附柱中硅胶膜上的漂洗液；8)将步骤7)处理后得到的吸附柱放入到一新的指形管中，在吸附柱中的硅胶膜上加入20 μ I RNase-free的超纯水，盖上管盖后室温静置5_10min ； 1000Orpm离心2_3min,指形管中收集的即为总RNA溶液样品。其中，上述指形管为1.5mL的RNase-free指形管。其中，上述裂解液为pH值7.0，浓度为30mmol/L的Tris-HCl、5mol/L异硫氰酸胍，1%β-巯基乙醇配制而成。其中，上述去除蛋白质溶液为pH值为7.0，浓度为15mmol/L的Tris-HCl，0.2mol/L异硫氰酸胍，10%无水乙醇配制而成。其中，上述漂洗液为pH 值为 7.0，浓度为 15mmol/L 的 Tris-HCl，80mmol/LNaCl，70%无水乙醇配制而成。本专利技术采用安捷伦(Agilent )2100型生物分析仪检测总RNA样品的浓度以及28S:18S等质量指标参数。有益效果:与现有技术相比，本专利技术提取的次级毛囊组织总RNA纯度高、完整性好，可进一步用于cDNA制备、目的基因克隆、实时荧光定量PCR检测以及高通量测序等相关领域的科研工作。本专利技术的方法也适用于从其他动物的毛囊组织中提取总RNA。【附图说明】图1采用安捷伦2100型生物分析仪检测提取的总RNA样品图；图2总RNA样品RT-PCR扩增GAPDH基因片段的琼脂糖凝胶电泳图；图中，左边第I泳道为标准分子量参照DL2000，从上至下片断大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp ;其余泳道均为提取的不同次级毛囊组织总RNA样品RT-PCR产物；图3总RNA样品RT-PCR扩增H-FABP基因片段的琼脂糖凝胶电泳图；图中，左边第I泳道为标准分子量参照DL2000，从上至下片断大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp ;其余泳道均为提取的不同次级毛囊组织总RNA样品RT-PCR产物；图4总RNA样品RT-PCR扩增KRTAP1-4基因片段的琼脂糖凝胶电泳图；图中，左边第I泳道为标准分子量参照DL2000，从上至下片断大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp ;其余泳道均为提取的不同次级毛囊组织总RNA样品RT-PCR产物；图5实时荧光定量PCR扩增曲线图；图中，横坐标为PCR扩增循环数，纵坐标为荧光强度；扩增曲线1、2、3分别代表β-actin、Noggin、BMP4基因扩增结果。【具体实施方式】下面结合具体实施例，进一步阐明本专利技术。实施例1: (一)提取次级毛囊组织总RNA前的准备工作采用硅胶膜吸附柱法提取不同绒山羊个体次级毛囊组织总RNA。提取过程如下:①样本的采集与处理在陕西省榆林市郊区养殖场采集5只陕北白绒山羊个体的次级毛囊组织。在每只羊的体侧部经碘酒和酒精棉球擦拭消毒，分别拔取5小撮羊毛和羊绒混合物，分别放入盛有RNAlater保存液的无RNase酶的1.5mL指形管中得到5个羊毛和羊绒混合物样本，盖紧管盖放入装有冷冻冰袋的保温箱中运送回实验室(从采样到送达实验室的时间为4天)，放置于4°C冰本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从绒山羊次级毛囊组织中提取总RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）采集、保存和运输毛囊组织：采集羊毛和羊绒混合物，经RNAlater保存液处理并低温保存使样品满足长途运输的需要；2）分离次级毛囊组织：在RNAlater保存液中从羊毛和羊绒混合物中分离出羊绒，在距离羊绒根部毛囊泡1cm处剪断，收集所有带有完整毛囊泡的羊绒根部，即分离得到次级毛囊组织；3）提取次级毛囊组织总RNA；4）检测总RNA样品质量。

【技术特征摘要】
1.一种从绒山羊次级毛囊组织中提取总RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)采集、保存和运输毛囊组织:采集羊毛和羊绒混合物，经RNAlater保存液处理并低温保存使样品满足长途运输的需要； 2)分离次级毛囊组织:在RNAlater保存液中从羊毛和羊绒混合物中分离出羊绒，在距离羊绒根部毛囊泡Icm处剪断，收集所有带有完整毛囊泡的羊绒根部，即分离得到次级毛囊组织； 3)提取次级毛囊组织总RNA； 4)检测总RNA样品质量。2.根据权利要求1所述的一种从绒山羊次级毛囊组织中提取总RNA的方法，其特征在于，所述步骤3)具体包括以下步骤: 1)将分离的次级毛囊组织迅速转移到裂解液中，用研磨杵研磨裂解液中的次级毛囊组织，充分研磨以破碎组织得到混合液，研磨时间为5-10min，小心用尖头镊子剔除绒干； 2)用移液器将研磨过的混合液转移到指形管中，1000Orpm离心3_5min，小心将上清液转移到指形管中； 3)向上清液中加入等体积的70%乙醇溶液并混匀，混匀后的溶液转移到硅胶膜吸附柱中，放入指形管后盖上管盖，1000Orpm离心2_3min,弃去废液后再将吸附柱放入到一新的指形管中； 4)向步骤3)处理后得到的吸附柱中加入500μ L去除蛋白质溶液，1000Orpm离心2-3min,弃去废液后再将吸附柱放入到一新的指形管中； 5)向步骤4)处理后得到的吸附柱中加入IU/μL DNase 1100 μ 1，室温静置15_20min ； ...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿荣庆，王兰萍，
申请(专利权)人：盐城师范学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32