本发明专利技术公开了一种活性污泥中总DNA的冻融改良式提取方法及其应用。充分利用梯度反复冻融法的优势，改良“CTAB+冻融+溶菌酶+蛋白酶法”DNA提取法，并应用到高盐度采油废水生物处理系统的活性污泥DNA的高效提取中。主要利用CTAB对传统DNA提取缓冲液进行改良，利用梯度冷冻并溶出的方法有效分离所需DNA片段，再应用溶菌酶和蛋白酶法完成高盐度采油废水净化系统中活性污泥的DNA高效提取。该方法具有分离纯化程度高，运行操作过程简单且稳定，避免了高盐度含油废水对提取过程的影响，同时，实践表明该方法对高盐度含油背景下污泥中多种不可预知杂质均有良好的分离功能。
【技术实现步骤摘要】
活性污泥中总DNA的冻融改良式提取方法及其应用
本专利技术属于环境科学领域，特别涉及一种活性污泥中总DNA的冻融改良式提取方法及其应用。
技术介绍
从天然的岩石下面采出的油水混合物经过油水分离后产生的水就叫采油废水。采油废水中含有许多有机和无机物，而且不同的油田所处的地理位置，地质结构，油田的开采寿命，开采石油烃的种类不同，所产生的采油废水的种类也不同。另外，由于钻井污水、洗井污水、生活污水等污水的混入，使得采油废水的成分更加复杂。通常情况下，采油废水有以下特点：(1)含油量高。通常采油废水中的原油含量可达1000-2000mg/L，部分油田的废水中的含油量甚至可达5000mg/L以上。依据含油颗粒在废水中的粒径可将其分为浮油、分散油、乳化油和溶解油。粒径大于100μm的浮油和10-100μm的分散油占废水中总含油量的90%左右，0.1-10μm的乳化油占10%，小于0.1μm的溶解油含量很低。(2)含盐量高。油田采油污水所含的盐主要是无机盐，一般不同的油田甚至不同区块、油层的含盐量都不同，从几千到十几万毫克升不等。所含的无机盐离子主要包括：Ca2+、Mg2+、K+、Na+、Fe2+、Cl−、SO42−、HCO3−和CO32−等。(3)含悬浮固体颗粒。一般是1-100μm的颗粒，主要包括粘土颗粒、粉砂和细砂等。(4)含细菌。一般以腐生菌和硫酸盐还原菌居多。(5)有些还含表面活性剂。此外，采油废水还有高温(40-80℃)和高pH值的特点。采油废水的处理可采用物理法、化学法、生物法、膜法及其相结合的方法。在这些处理方法中生物处理法因其运行费用低，操作简便等特点而被广泛的应用。通常对采油废水处理的生物处理法可分为：活性污泥法、生物膜法、生物接触氧化池、氧化塘等。活性污泥法是在处理可生物降解的污水中最常见的技术，该方法对废水的处理可分为生物和物理两个阶段，在生物阶段主要是活性污泥中的微生物降解废水中的有机物、铵盐和磷酸盐等物质。在该技术中对处理效果起关键性作用的就是活性污泥中微生物的活性，而微生物的活性又由活性污泥中微生物的群落结构和特征所决定。活性污泥中的微生物群落很丰富，主要由细菌、真菌、古菌、放线菌、藻类、原生动物和后生动物等构成，其中最主要的是细菌，大约占整个活性污泥微生物群落的95%。因此，细菌是活性污泥废水处理系统中有机物、铵盐和磷酸盐等物质有效去除的重要保障。然而，对细菌的菌种鉴定、筛选和基因工程菌的合成中，DNA的高效提取为其关键技术，因此，国内外大量学者开展DNA提取方法研究。采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）+梯度反复冻融法+溶菌酶+蛋白酶法开展菌种DNA提取研究，利于分析采油废水处理系统活性污泥中细菌、真菌在种类和数量上的变化。研究结果可为后续活性污泥筛选高效除油菌株、构建高效除油复合菌群提供理论依据，同时对指导实际生产运行具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种活性污泥中总DNA的冻融改良式提取方法及其应用。本专利技术的思路：充分利用梯度反复冻融法的优势，改良“CTAB+冻融+溶菌酶+蛋白酶法”DNA提取法，并应用到高盐度采油废水生物处理系统的活性污泥DNA的高效提取中。本专利技术的机理：利用CTAB对传统DNA提取缓冲液进行改良，利用梯度冷冻并溶出的方法有效分离所需DNA片段，再应用溶菌酶和蛋白酶法完成高盐度采油废水净化系统中活性污泥的DNA高效提取。具体步骤为：(1)均匀取得目标DNA来源体污泥20~30mL，其含水率大于98%，置于100mL离心管中，以6000~8000r/min的转速进行离心预处理5~8min，弃去上清液，过快速滤纸收集沉淀物质待用，所收集的沉淀物质小于1mL。(2)将步骤(1)所收集的沉淀物质加入到2mL的具塞离心管中，并加入1~2mL的DNA提取缓冲液，漩涡振荡器振荡5~10min后待用；所述DNA提取缓冲液含有100~150mmol/L的EDTA、100~150mmol/L的Tris-HCl、1.5~3.0mol/L的NaCl、质量百分比浓度为2~5%的CTAB和质量百分比浓度为1~3%的PVPP，并使用0.1~0.5mol/L的HCl和NaOH稀溶液调节DNA提取缓冲液的pH值至8.0。(3)将步骤(1)制得的物质放入-80℃冰箱中冷冻6~8min，然后放入65℃水浴锅中水浴10~15min，再放入-60℃超低温冰箱冷冻10~15min，然后放入65℃水浴锅中水浴10~15min，接着放入-40℃超低温冰箱冷冻25~30min，然后放入65℃水浴锅中水浴10min；每次冷冻后的水浴期间均要求颠倒混匀1~2次，完成梯度升温冷冻-水浴解冻而制得样品备用。(4)向步骤(3)制得的样品中加入80~100μL浓度为10mg/mL的溶菌酶，置于37℃水浴中培养10~15min，每隔2~3min上下颠倒混匀一次，然后加入10~15μL浓度为10mg/mL蛋白酶K和150~200μL质量百分比浓度为10%的SDS，65℃水浴10min，然后直接放入-80℃冰箱中速冻6~8min，最后在65℃温水中解冻28~32min；重复本冻融步骤3次，制得样品备用。(5)将步骤(4)制得的样品在常温下以6000~8000r/min的转速离心10~15min，取上清液分装于2mL的离心管中，加入等体积的体积比为1:1的Tris饱和酚-氯仿混合液，上下颠倒混匀，在8000~10000r/min的转速下离心10~15min，即完成抽提，本抽提步骤重复2次，制得上清液备用。(6)将步骤(5)制得的上清液转移到1~2mL的离心管中，加入为上清液0.6~0.8倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置1~1.5h，在10000-120000r/min的转速下离心10~15min，弃掉上清液，用预冷的50~70%的乙醇洗涤沉淀2~3次，在8000~10000r/min的转速下离心2~5min，用无水乙醇连续漂洗2次，弃上清液后，室温下风干，加入30μL无菌水即制得目标样品，目标样品在-20℃下保存。本专利技术方法应用于高盐度采油废水处理系统活性污泥总DNA的提取。采用本专利技术方法对高盐度采油废水处理系统活性污泥中总DNA的提取具有分离纯化程度高，运行操作过程简单且稳定，避免了高盐度含油废水对提取过程的影响，同时，该方法对高盐度含油背景下污泥中多种不可预知杂质均有良好的分离功能。附图说明图1为本专利技术实施例中对SBR池活性污泥中总DNA不同提取方法的琼脂糖检测图。其中M为λ-DNAmarker，泳道1为方法二提取的总DNA结果，泳道2为方法1提取的总DNA结果。具体实施方式实施例：取中海石油（中国）有限公司湛江分公司涠洲终端处理厂SBR池污泥20mL，加入到100mL的离心管中，以8000r/min的转速进行离心预处理5min，去上清液，收集沉淀0.95mL加入到2mL具塞离心管中，并加入1mLpH为8.0的DNA提取缓冲液（含100mmol/LEDTA、100mmol/LTris、1.5mol/LNaCl、2%CTAB和1%PVPP），用漩涡振荡器振荡5min后，置于-80℃冰箱中冷冻6min，然后放入65℃水浴锅中水浴10min；再放入-60℃冰箱中冷冻10min，然后放入65℃水浴锅中水浴1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种活性污泥中总DNA的冻融改良式提取方法，其特征在于具体步骤为：(1)均匀取得目标DNA来源体污泥20~30mL，其含水率大于98%，置于100mL离心管中，以6000~8000r/min的转速进行离心预处理5~8min，弃去上清液，过快速滤纸收集沉淀物质待用，所收集的沉淀物质小于1mL；(2)将步骤(1)所收集的沉淀物质加入到2mL的具塞离心管中，并加入1~2mL的DNA提取缓冲液，漩涡振荡器振荡5~10min后待用；所述DNA提取缓冲液含有100~150mmol/L的EDTA、100~150mmol/L的Tris‑HCl、1.5~3.0mol/L的NaCl、质量百分比浓度为2~5% 的CTAB和质量百分比浓度为1~3% 的PVPP，并使用0.1~0.5mol/L的HCl和NaOH稀溶液调节DNA提取缓冲液的pH值至8.0；(3)将步骤(1)制得的物质放入‑80℃冰箱中冷冻6~8min，然后放入65℃水浴锅中水浴10~15min，再放入‑60℃超低温冰箱冷冻10~15min，然后放入65℃水浴锅中水浴10~15min，接着放入‑40℃超低温冰箱冷冻25~30min，然后放入65℃水浴锅中水浴10min；每次冷冻后的水浴期间均要求颠倒混匀1~2次，完成梯度升温冷冻‑水浴解冻而制得样品备用；(4)向步骤(3)制得的样品中加入80~100μL浓度为10mg/mL的溶菌酶，置于37℃水浴中培养10~15min，每隔2~3min上下颠倒混匀一次，然后加入10~15μL浓度为10mg/mL蛋白酶K和150~200 μL 质量百分比浓度为10%的SDS，65℃水浴10min，然后直接放入‑80℃冰箱中速冻6~8min，最后在65℃温水中解冻28~32min；重复本冻融步骤3次，制得样品备用；(5)将步骤(4)制得的样品在常温下以6000~8000r/min的转速离心10~15min，取上清液分装于2mL的离心管中，加入等体积的体积比为1:1的Tris饱和酚‑氯仿混合液，上下颠倒混匀，在8000~10000r/min的转速下离心10~15min，即完成抽提，本抽提步骤重复2次，制得上清液备用；(6)将步骤(5)制得的上清液转移到1~2mL的离心管中，加入为上清液0.6~0.8倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置1~1.5h，在10000‑120000r/min的转速下离心10~15min，弃掉上清液，用预冷的50~70%的乙醇洗涤沉淀2~3次，在8000~10000r/min的转速下离心2~5min，用无水乙醇连续漂洗2次，弃上清液后，室温下风干，加入30μL无菌水即制得目标样品，目标样品在‑20℃下保存。...
【技术特征摘要】
1.一种活性污泥中总DNA的冻融改良式提取方法，其特征在于具体步骤为：(1)均匀取得目标DNA来源体污泥20~30mL，其含水率大于98%，置于100mL离心管中，以6000~8000r/min的转速进行离心预处理5~8min，弃去上清液，过快速滤纸收集沉淀物质待用，所收集的沉淀物质小于1mL；(2)将步骤(1)所收集的沉淀物质加入到2mL的具塞离心管中，并加入1~2mL的DNA提取缓冲液，漩涡振荡器振荡5~10min后待用；所述DNA提取缓冲液含有100~150mmol/L的EDTA、100~150mmol/L的Tris-HCl、1.5~3.0mol/L的NaCl、质量百分比浓度为2~5%的CTAB和质量百分比浓度为1~3%的PVPP，并使用0.1~0.5mol/L的HCl和NaOH稀溶液调节DNA提取缓冲液的pH值至8.0；(3)将步骤(2)制得的物质放入-80℃冰箱中冷冻6~8min，然后放入65℃水浴锅中水浴10~15min，再放入-60℃超低温冰箱冷冻10~15min，然后放入65℃水浴锅中水浴10~15min，接着放入-40℃超低温冰箱冷冻25~30min，然后放入65℃水浴锅中水浴10min；每次冷冻后的水浴期间均要求颠倒混匀1~2次，完成梯度升温冷冻-水浴解冻而制得样品备用；(4)向步骤(3)制得的样品中加入80~100μL浓度为10mg/mL的溶菌酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：李艳红，解庆林，朱宗强，曾鸿鹄，梁延鹏，王帅，陈有为，
申请(专利权)人：桂林理工大学，
类型：发明
国别省市：广西;45
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