一种猪小肠抗菌肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪小肠抗菌肽的制备方法，首先将前处理后的猪小肠在80‑100℃的水中热处理至肠壁褶皱，达到提高原料使用率和反复冻融时细胞破碎更加充分的目的；然后制备猪小肠匀浆液，将匀浆液与注射用水按照质量比100∶90‑99混合均匀后反复冻融5‑6次，再将匀浆液与乙酸按照质量比100∶1‑10混合均匀，沸水浴，冷却离心，分别收集沉淀物和一次上清液；再将沉淀物与注射用水按照质量比1∶1.8‑2.2混合均匀后离心，收集二次上清液体，上清液合并后依次经过切向流过滤，超滤，调节pH值并再次过滤，最终得到猪小肠抗菌肽。本发明专利技术方法能够在不降低抗菌肽溶液浓度的前提下，解决渗透压过高问题，从而提高抗菌肽提取质量。

【技术实现步骤摘要】
一种猪小肠抗菌肽的制备方法
本专利技术属于医药生物
，具体涉及一种猪小肠抗菌肽的制备方法。
技术介绍
抗菌肽是生物体产生的一种具有强抗菌作用的活性多肽，是生物先天免疫的重要组成成分。迄今为止，已在许多生物包括动物、植物及原核生物中发现多种内源性抗菌活性肽。猪源抗菌肽是从猪体内分离得到的抗菌肽。由于抗菌肽具有广谱杀菌作用、相对分子量较小、热稳定及水溶性好等优点，更为重要的是抗菌肽可作用于原核细胞和发生病变的真核细胞且不易使病原微生物产生耐药的特点；因此，在当前人类滥用抗生素所带来的全球耐药性的严峻问题下，对于了解猪体内自然产生的抗菌肽的功能，以及设计一种方法来制备猪源抗菌肽以求替代抗生素的研究，便显得极为重要，这势必将对寻找抗生素替代品的研究与应用起到积极的促进作用。现有提取猪小肠抗菌肽的方法，一般如下：取新鲜猪小肠，前处理后冷冻剪碎，组织捣碎机捣碎后，再用超声波细胞粉碎机破碎，匀浆后，按1∶1(v/v)加入5％乙酸，于4℃条件下搅拌过夜，次日，沸水浴15min，然后冰水浴，使其迅速冷却。将混合物于4℃条件下，8,000rpm离心30min，取上清，4℃保存。将沉淀物用等体积5％乙酸混合，再次于4℃搅拌浸提过夜，重复上述离心过程，取上清，合并两次上清液，调整pH值，再次离心，弃沉淀，上清液冷冻干燥即为抗菌肽类物质粗制品。现有技术在粗提猪小肠抗菌肽组织捣碎的过程中，因含有较大组织块，匀浆捣碎时，会对机器造成较大损伤，并且会降低原料使用率；当组织捣碎不够充分时，会影响反复冻融时细胞破碎的程度，最终影响抗菌肽的提取。另外，提取出的抗菌肽溶液存在渗透压过高问题，即使在后期加入注射用水降低渗透压，还是会造成抗菌肽溶液浓度降低问题，从而降低产品质量；此外，在进行二次浸提时，不仅提取的多肽类物质显著少于第一次提取，而且还会加重渗透压过高的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种在不降低抗菌肽溶液浓度的前提下，解决渗透压过高问题从而提高抗菌肽提取质量的猪小肠抗菌肽的制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种猪小肠抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：1)取新鲜或解冻的猪小肠，去除猪小肠表面的筋膜、脂肪组织和小肠内容物，用注射用水冲洗干净，然后将猪小肠放置于80-100℃热水中处理至肠壁出现褶皱，迅速冷却后用绞肉机绞碎，接着用胶体磨匀浆3次，得到猪小肠匀浆液；2)将上述匀浆液与注射用水按照质量比100∶90-99混合均匀，然后将混合均匀后的匀浆液分装于无热源的容器中并置于冻库中冷冻，待冷冻完全后取出，再置于室温流水中解冻，如此反复冻融5-6次；3)将反复冻融后的匀浆液与乙酸(分析纯)按照质量比100∶1-10混合均匀，于4℃搅拌12小时后得到混合液，将混合液沸水浴8-15min，然后将混合液置于冰水中迅速冷却，离心，分别收集沉淀物和一次上清液，将一次上清液于4℃保存；4)将上述沉淀物与注射用水按照质量比1∶1.8-2.2混合均匀，于4℃搅拌12小时后得到浸提液，将浸提液在温度-10℃以下，冷冻2-4小时后(待浸提液表层出现冰渣，停止冷冻)离心，收集二次上清液体；5)合并一次上清液和二次上清液，将合并后的上清液依次经过0.22-0.45μm和5-10kD滤膜进行切向流过滤，收集滤膜透过液，得到超滤液；调节超滤液pH值至5.0-7.2之间，再经0.1μm-0.22μm除菌滤器过滤，得到猪小肠抗菌肽。进一步，所述步骤2)，匀浆液与注射用水的质量比为100∶97.13。进一步，所述步骤3)，反复冻融后的匀浆液与乙酸的质量比为100∶2.87。进一步，所述步骤3)，混合液在搅拌条件下进行沸水浴。进一步，所述步骤3)，冷却后的混合液于4℃、6000-7500r/min离心20-30min。进一步，所述步骤4)，沉淀物与注射用水的质量比为1∶2.12。进一步，所述步骤4)，冷冻后的浸提液于4℃、6000-7500r/min离心20-30min。本专利技术采用以上技术方案，在猪小肠冷却绞碎前，增加一个热处理步骤，即前期处理后的小肠在温度为80-100℃热水中处理15-25s，再迅速冷却，随后剪碎，捣碎，该方法可以使猪小肠在绞肉机及胶体磨中匀浆时，猪小肠碾磨的比未热处理的更细，几乎不会有大颗粒的组织存在，不仅提高原料的使用率，而且能够减少对仪器的损伤。同时，由于不存在大颗粒的组织块，随后进行的反复冻融过程，能够更加充分的破碎细胞，释放更多的猪小肠抗菌肽。本专利技术所述步骤3)，混合液在沸水浴过程中，搅拌机应不断搅拌以保证受热均匀，反复冻融后的匀浆液与乙酸按照质量比100∶1-10混合均匀，优选为1∶2.87％，2.87％的乙酸溶液提取多肽类物质含量不仅与5％乙酸溶液提取的差异不明显，而且2.87％的乙酸溶液提取的抗菌肽溶液渗透压是5％乙酸溶液提取的一半，避免出现渗透压过高的现象。本专利技术所述步骤4)，将沉淀物与注射用水按照质量比1∶1.8-2.2混合均匀，于4℃搅拌12小时得到浸提液，以注射用水当第二次浸提液，不仅可以起到和2.87％乙酸溶液相同的作用，而且所获得的二次上清液跟一次上清液液混合之后能够起到平衡渗透压的作用。本专利技术所述步骤5)，合并一次上清液和二次上清液，将合并后的上清液依次经过0.22-0.45μm、5-10kD滤膜进行切向流过滤以及0.1μm-0.22μm除菌滤器过滤，调节滤过液pH值至5.0-7.2之间，从而获得猪小肠抗菌肽溶液。经过微滤、超滤和除菌过滤的猪小肠抗菌肽溶液符合兽药生物制品无菌及无内毒素要求，可直接使用于动物注射，避免由于渗透压过高引起动物应激。具体实施方式一种猪小肠抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：1)取新鲜或解冻的猪小肠，去除猪小肠表面的筋膜、脂肪组织和小肠内容物，用注射用水冲洗干净，然后将猪小肠放置于80-100℃热水中处理至肠壁褶皱，迅速冷却后用绞肉机绞碎，接着用胶体磨匀浆3次，得到猪小肠匀浆液；2)将上述匀浆液与注射用水按照质量比100∶90-99混合均匀，然后将混合均匀后的匀浆液分装于无热源的容器中并置于冻库中冷冻，待冷冻完全后取出，再置于室温流水中解冻，如此反复冻融5-6次；3)将反复冻融后的匀浆液与乙酸按照质量比100∶1-10混合均匀，于4℃搅拌12小时后得到混合液，将混合液在搅拌条件下沸水浴8-15min，然后将混合液置于冰水中迅速冷却，于4℃、6000-7500r/min离心20-30min，分别收集沉淀物和一次上清液，将一次上清液于4℃保存；4)将上述沉淀物与注射用水按照质量比1∶1.8-2.2混合均匀，于4℃搅拌12小时后得到浸提液，将浸提液在温度-10℃以下，冷冻2-4小时后(待浸提液表层出现冰渣，停止冷冻)于4℃、6000-7500r/min离心20-30min，收集二次上清液体；5)合并一次上清液和二次上清液，将合并后的上清液依次经过0.22-0.45μm和5-10kD滤膜进行切向流过滤，收集滤膜透过液，得到超滤液；调节超滤液pH值至5.0-7.2之间，再经0.1μm-0.22μm除菌滤器过滤，得到猪小肠抗菌肽。实施例1一种猪小肠抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：1)取新鲜或解冻的猪小肠，去除猪小肠表面的筋膜、脂肪组织和小肠内容物，用注射用水冲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪小肠抗菌肽的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：1) 取猪小肠，去除猪小肠表面的筋膜、脂肪组织和小肠内容物，用水冲洗干净，然后将猪小肠在80‑100℃的水中热处理至肠壁出现褶皱，热处理结束后置于冰水中冷却，冷却后用绞肉机绞碎，接着用胶体磨匀浆，得到猪小肠匀浆液；2）将上述匀浆液与注射用水按照质量比100∶90‑99混合均匀，然后将混合均匀后的匀浆液反复冻融5‑6次；3 将反复冻融后的匀浆液与乙酸按照质量比100∶1‑10混合均匀，于4℃搅拌12小时后得到混合液，将混合液沸水浴8‑15min，然后将混合液置于冰水中冷却，离心，分别收集沉淀物和一次上清液，将一次上清液于4℃保存；4）将上述沉淀物与注射用水按照质量比1∶1.8‑2.2混合均匀，于4℃搅拌12小时后得到浸提液，将浸提液在温度‑10℃以下，冷冻2‑4小时后离心，收集二次上清液体；5）合并一次上清液和二次上清液，将合并后的上清液依次经过0.22‑0.45 μm和5‑10 kD滤膜进行切向流过滤，收集滤膜透过液，得到超滤液；调节超滤液pH值至5.0‑7.2之间，再经0.1 μm‑0.22 μm除菌滤器过滤，得到猪小肠抗菌肽。

【技术特征摘要】
1.一种猪小肠抗菌肽的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：1)取猪小肠，去除猪小肠表面的筋膜、脂肪组织和小肠内容物，用水冲洗干净，然后将猪小肠在80-100℃的水中热处理至肠壁出现褶皱，热处理结束后置于冰水中冷却，冷却后用绞肉机绞碎，接着用胶体磨匀浆，得到猪小肠匀浆液；2）将上述匀浆液与注射用水按照质量比100∶90-99混合均匀，然后将混合均匀后的匀浆液反复冻融5-6次；3将反复冻融后的匀浆液与乙酸按照质量比100∶1-10混合均匀，于4℃搅拌12小时后得到混合液，将混合液沸水浴8-15min，然后将混合液置于冰水中冷却，离心，分别收集沉淀物和一次上清液，将一次上清液于4℃保存；4）将上述沉淀物与注射用水按照质量比1∶1.8-2.2混合均匀，于4℃搅拌12小时后得到浸提液，将浸提液在温度-10℃以下，冷冻2-4小时后离心，收集二次上清液体；5）合并一次上清液和二次上清液，将合并后的上清液依次经过0.22-0.45μm和5-10kD滤膜进行切向流过滤，收集滤膜透过液，得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：马绍伟，罗贵峰，徐磊，刘友霖，
申请(专利权)人：派生特福州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35