本发明专利技术公开了一种用于检测小鼠汉坦病毒的引物、探针及其方法。使用含所述引物、探针的试剂盒检测小鼠汉坦病毒简单方便、灵敏度高且检测时间短。尤其在进行汉滩病毒、汉城病毒和普马拉病毒三种汉坦病毒联合检测时，大大节省了时间，更经济省力，解决了现有检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求的不足，具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，特别是涉及一种用于检测小鼠汉坦病毒的实时荧光 PCR引物、探针及其试剂盒。
技术介绍
自然感染实验动物的病毒很多，根据对人类的危害性，可将其分为三类；一类为人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物；二类目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性；三类病毒在自然条件下仅感染动物本身，目前尚无迹象表明能够感染人，因此对人类威胁不大。现今，小鼠作为单克隆抗体、蛋白类药物等生物制品的一个主要来源，具有潜在的病毒污染。在《中华人民共和国药典(2010年版)》三部中，规定了鼠源性生物制品需质检的 8种鼠源病毒，其中鼠源RNA病毒有6种，分别为小鼠肺炎病毒(Pneumonia Virus of Mice, PVM)、汉坦病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic Choriomeningitis Virus, LCMV)、呼肠孤病毒III型(Reovirus 3，Reo3)、仙台病毒(Sendai virus，SEV)、小鼠白血病病毒(Murine leukemia virus，简称MuLV或MLV)，这些病毒属于一类或二类，为人畜共患病毒或对人类有潜在危险性。鼠源性病毒检测标准的制定对客观评价生物制品质量，确保人民健康必将起到积极的作用。其中，汉坦病毒归属布尼亚病毒科，是一种有包膜分节段的负链RNA病毒，基因级为单负链RNA，分3个节断，由核衣壳包绕，有包膜。病毒增殖时，以负链RNA为模板产生正链RNA和mRNA，由正链RNA复制子代病毒基因级，出芽释放获得包膜。基因组包括L、M、S3 个片段，分别编码L聚合酶蛋白、Gl和G2糖蛋白、核蛋白。汉坦病毒包括引起肾综合征出血热(HFRS)的汉滩病毒(Hantaan virus，HTNV)、汉城病毒(Seoul virus，SE0V)、普马拉病毒(Puumala virus, PUUV)、多不拉伐病毒(Dobrava virus, D0BV)及引起汉坦病毒肺综合征(HPS)的无名病毒(Sin Nombre virus, SNV)、纽约病毒(New York virus, NYV)等。在国内常见的是肾综合征出血热(HFRS)，引起肾综合征出血热的汉坦病毒包括汉坦病毒(HTNV)，汉城病毒(SEOV)和普马拉病毒(PUUV)，分别引起重度，中度和轻度的临床症状。肾综合征出血热具有明显的地区性和季节性，以10 12月份为多见，与鼠类的分布与活动有关。携带病毒的鼠(如黑线姬鼠)，通过唾液、尿、粪污染环境。人经呼吸道、消化道或直接接触等方式被传染。病毒导致全身毛细血管内皮细胞和小血管损伤，引起高热、出血、肾脏损害和免疫功能紊乱等临床表现。药典规定的鼠源病毒检测方法有细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。 这些方法从生物效应角度来检测鼠源病毒的潜在污染，检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求，不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。而目前发展十分成熟的实时荧光PCR技术(Real-time Fluorence Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)检测灵敏度高，简单方便，且对实验室要求也很低。 Real Time PCR于1996年由美国Applied biosystems公司推出，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过 Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定性定量分析的方法。该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着Taqman荧光探针的广泛应用，到目前为止该技术已经非常成熟。Taqman荧光探针的PCR检测是指进行PCR扩增时，在反应体系中加入一对引物的同时还加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基因和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基因所发射的荧光信号被淬灭基因吸收，扩增时随着Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’_3’外切核酸酶活性将探针酶切降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以监测到荧光信号，模板每复制一次，就有一个探针被切断伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一关系，所以信号累积与PCR产物完全同步。整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及样品中的扩增曲线可对样品进行定性定量分析。实时荧光PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定性或定量，而且具有灵敏度和特异性高、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该已被广泛用于免疫分析、细菌、病毒检测等多个领域。经基因序列比较得知，HTNV、SE0V、D0BV间的Ns基因同源率较低，使用实时荧光PCR技术分别对HTNV、SEOV, DOBV进行检测或对这3种病毒同时进行检测方面还未见有报道。
技术实现思路
为了解决现有小鼠汉坦病毒检测方法的不足，本专利技术提供了一种实时荧光PCR检测小鼠汉坦病毒的引物、探针、试剂盒及其方法，使用含所述引物、探针的试剂盒检测简单方便、灵敏度高且检测时间短。尤其在进行联合检测时，大大节省了时间，更经济省力。本专利技术的一个目的是提供一种用于检测小鼠汉坦病毒的实时荧光PCR引物，其中，所述引物选自特异性地扩增汉滩病毒、汉城病毒和普马拉病毒的专用引物中的至少一对，其中，特异性地扩增汉滩病毒的专用引物是由具有序列表中的SEQ ID NO :1的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO 2的下游引物组成的一对寡核苷酸；特异性地扩增汉城病毒的专用引物是由具有序列表中的SEQ ID NO :3的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO 4的下游引物组成的一对寡核苷酸；特异性地扩增普马拉病毒的专用引物是由具有序列表中的SEQ ID NO 5的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO :6的下游引物组成的一对寡核苷酸。本专利技术的另一个目的是提供一种可与上述提及引物配合使用的探针，其中，所述探针选自特异性地扩增汉滩病毒、汉城病毒和普马拉病毒的专用探针中的至少一种，其中，特异性地扩增汉滩病毒的专用探针具有序列表中的SEQ ID NO 7核苷酸序列；特异性地扩增汉城病毒的专用探针具有序列表中的SEQ ID NO 8核苷酸序列；特异性地扩增普马拉病毒的专用探针具有序列表中的SEQ ID NO 9核苷酸序列。优选地，所述探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。优选地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、HEX中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自TAMRA或Eclipse。优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。本专利技术的又一个目的是提供一种用于检测小鼠汉坦病毒的实时荧光PCR试剂盒， 其中，所述试剂盒包括上述提及的引物、探针。优选地，所述试剂盒还包括RT-PCR扩增试剂、阳性RNA标准品、酵母tRNA稀释液、 阴性质控品、空白对照。优选地，所述RT-PCR扩增试剂为 2 X Taqman PCR Mix,40 X TaqmanRT-Enzyme MIX。优选地，所述阳性R本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．用于检测小鼠汉坦病毒的实时荧光ＰＣＲ引物，其特征在于，所述引物选自特异性地扩增汉滩病毒、汉城病毒和普马拉病毒的专用引物中的至少一对，其中，特异性地扩增汉滩病毒的专用引物是由具有序列表中的ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１的上游引物与具有序列表中的ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２的下游引物组成的一对寡核苷酸；特异性地扩增汉城病毒的专用引物是由具有序列表中的ＳＥＱ ＩＤＮＯ：３的上游引物与具有序列表中的ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４的下游引物组成的一对寡核苷酸；特异性地扩增普马拉病毒的专用引物是由具有序列表中的ＳＥＱ ＩＤＮＯ：５的上游引物与具有序列表中的ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６的下游引物组成的一对寡核苷酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谭淑萍，李萃，王刚，蒋立新，周志文，
申请(专利权)人：舒泰神北京生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：11
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