早老素PS1基因环化基因序列及其表达方法和荧光定量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种早老素PS1基因环化基因序列及其表达方法和荧光定量检测方法，所述早老素PS1基因环化基因PS1基因的第2和第5外显子首尾连接环化，早老素PS1基因环化基因序列的编码区的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术为阿尔茨海默病疾病的早期临床诊断提供了理想的诊断marker。本发明专利技术通过反向PCR后克隆测序的方法在人神经母细胞瘤SY5Y细胞系中鉴定出了人早老素基因PSEN1(presenilin 1，PS1)的一种环化的分子。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种早老素PS1基因环化基因序列及其表达方法和荧光定量检测方法；为阿尔茨海默病疾病的早期临床诊断提供了理想的诊断marker。
技术介绍
以往研究主要是在病毒中发现存在环状RNA(circularRNA,circRNA)，1993年Cocquerelle等在人体细胞中发现了circRNA，在过去的30年间由于技术水平的限制，把这部分客观存在的RNA忽略了，近年来，随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才在哺乳动物体内发现大量客观存在的环状circRNA，环化RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定，另外也有研究者在古细菌中发现了环状RNA.环状RNA由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成，环状RNA通常是由一个以上外显子构成的RNA分子。阿尔茨海默病(Alzheimer’Sdisease，AD)是一种不可逆性神经系统变性疾病，AD有家族遗传性和散发性两种。家族遗传性老年性痴呆(FamilialAlzheimerDisease，FAD)又分为早发型(EOFAD)和晚发型(LOFAD)，被认为是常染色体显性遗传疾病。通过基因扫描和定位克隆方法已筛选出4种与AD明确相关的致病基因，即位于21q11.2－21q21区域的APP基因、19q13－13.2区域的APOE基因、14q24.3区域的早老素1(PS1)基因、和1q31－42区的早老r>素PS2基因，其中PS1基因可能是EOFAD的主要责任基因。早老素基因PS1是γ-分泌酶的核心组成成分，γ-分泌酶复合物是由四个膜整合蛋白组成的包含19次跨膜螺旋的复合体，包括PS1，Aph-1，Pen-2和Nicastrin四个亚基，其中早老素PS1是执行酶活功能的膜整合蛋白酶活性亚基，任何一个亚单位的表达水平降低都会导致酶复合体形成障碍。对人的早老素基因PSEN1(presenilin1,PS1)基因的全长RNA序列进行分析，PS1(基因登录号NM_000021.3)mRNA由12个外显子组成；有文献报道环状RNA在生物体内大量存在，多是由外显子参与环化；然而，目前在这一领域并没有更深入的研究。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种早老素PS1基因环化基因序列，为阿尔茨海默病疾病的早期临床诊断提供了理想的诊断marker。为解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：早老素PS1基因环化基因序列，PS1基因的第2和第5外显子首尾连接环化，早老素PS1基因环化基因序列的编码区的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。进一步的，上述方案中，PCR扩增所述早老素PS1基因环化基因序列的引物序列为下列引物对中的一对：早老素PS1基因环化蛋白，早老素PS1基因环化蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。本专利技术的另一目的在于提供所述早老素PS1基因环化基因序列的表达方法，通过反向PCR后克隆测序的方法在人神经母细胞瘤SY5Y细胞系中鉴定出了人早老素基因PSEN1(presenilin1，PS1)的一种环化的分子。一种早老素PS1基因环化基因序列的表达方法，所述表达方法步骤如下：1)提总RNA：提取SH-SY5Y细胞的总RNA；2)除去提取的RNA中残留的基因组DNA：在上述提取的总RNA中加入反应液，经过消化、灭活后除去残留的基因组DNA；3)将RNA逆转录成cDNA：在PCR管中加入上述RNA作为模板、采用随机逆转录引物，在PCR体系中逆转录成cDNA；4)引物设计及PCR扩增克隆测序：根据PS1基因的RNA序列设计12对反向PCR扩增引物SEQIDNO.2-SEQIDNO.25，先反向扩增PCR扩增PS1的外显子，电泳检测PCR产物，然后将PCR产物克隆到PMD18-TA克隆载体中，用上述引物进行PCR反应，反应完取PCR产物电泳；将PCR产物切胶回收，使用胶回收试剂盒回收纯化，然后用T4连接酶将目标片段连接到PMD18-TA克隆载体中，再将产物转化到DH5a大肠杆菌，过夜培养；第二天挑取单克隆做DNA测序鉴定，第2和第5外显子首尾连接环化，即cDNA核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的早老素PS1基因环化基因序列。进一步的，上述表达方法中，步骤4)的PCR反应体系为20微升体系:具2×PCRMIX10μL，10mM上、下游引物各1μL，cDNA模板1μL，用灭菌水补足20μL；反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃30s变性，58℃30s退火，72℃延伸30s，共30个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸5min，然后16℃保存。进一步的，上述表达方法中，步骤1)采用Lifetechnologies公司生产的Reagent试剂盒提取总RNA。进一步的，上述表达方法中，步骤2)的反应液总体积为20μL，由如下组分组成：步骤1)提取的提取的总RNA在上述反应液中于37℃消化30min后，加入0.5μlEDTA，65℃灭活10min。进一步的，上述表达方法中，步骤3)逆转录的PCR体系为：RNasefreeddH2Oupto1补足至10μL；反应条件为：25℃5min，42℃20min，85℃5min，4℃2min。早老素PS1基因环化基因序列的荧光定量检测方法，该荧光定量检测方法包括以下步骤：1)提总RNA：提取SH-SY5Y细胞的总RNA；2)除去提取的RNA中残留的基因组DNA：在上述提取的总RNA中加入反应液，经过消化、灭活后除去残留的基因组DNA；3)将RNA逆转录成cDNA：在PCR管中加入上述RNA作为模板、采用随机逆转录引物，在PCR体系中逆转录成cDNA；4)采用荧光定量反应Real-timePCR试剂盒，配置反应体系对老年痴呆患者血液标本进行检测，体检测反应体系如下：其中，上游引物为：5’TGTATAAATACAGGTGCTATAAGACCTAA3’下游引物为：5’TGCAGGTAACTCTGTCATTGG；荧光定量PCR反应条件为95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒；40个循环，温度60℃-95℃收集荧光信号，然后进行融解曲线分析。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：1.本专利技术针对12个外显子分别设计反向PCR引物，来扩增可能存在的环化的RNA；获得了一种由PS1mRNA的第2、3、4、5外显子环化而成的环化基因序列，此环化基因序列全长序列为615个核苷酸；2.本本文档来自技高网...

【技术保护点】
早老素PS1基因环化基因序列，其特征在于，PS1基因的第2和第5外显子首尾连接环化，早老素PS1基因环化基因序列的编码区的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.早老素PS1基因环化基因序列，其特征在于，PS1基因的第2和第5外
显子首尾连接环化，早老素PS1基因环化基因序列的编码区的核苷酸序列为SEQ
IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的早老素PS1基因环化基因序列，其特征在于，PCR
扩增所述早老素PS1基因环化基因序列的引物序列为下列引物对中的一对：
3.早老素PS1基因环化蛋白，其特征在于，早老素PS1基因环化蛋白的核

\t苷酸序列为SEQIDNO.1所示。
4.一种如权利要求1所述的早老素PS1基因环化基因序列的表达方法，其
特征在于，所述表达方法步骤如下：
1)提总RNA：提取SH-SY5Y细胞的总RNA；
2)除去提取的RNA中残留的基因组DNA：在上述提取的总RNA中加入
反应液，经过消化、灭活后除去残留的基因组DNA；
3)将RNA逆转录成cDNA：在PCR管中加入上述RNA作为模板、采用
随机逆转录引物，在PCR体系中逆转录成cDNA；
4)引物设计及PCR扩增克隆测序：根据PS1基因的RNA序列设计12对
反向PCR扩增引物SEQIDNO.2-SEQIDNO.25，先反向扩增PCR扩增PS1的
外显子，电泳检测PCR产物，然后将PCR产物克隆到PMD18-TA克隆载体中，
用上述引物进行PCR反应，反应完取PCR产物电泳；将PCR产物切胶回收，
使用胶回收试剂盒回收纯化，然后用T4连接酶将目标片段连接到PMD18-TA
克隆载体中，再将产物转化到DH5a大肠杆菌，过夜培养；第二天挑取单克隆做
DNA测序鉴定，第2和第5外显子首尾连接环化，即cDNA核苷酸序列如SEQ
IDNO:1所示的早老素PS1基因环化基因序列。
5.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于，步骤4)的PCR反应体
系为20微升体系:2×PCRMIX10μL，10mM上、下游引物各1μL，cDNA模板
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【专利技术属性】
技术研发人员：张茂雷，胡国艳，
申请(专利权)人：广州吉赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44