本发明专利技术公开了一种肝癌中环状RNA-MET基因及其表达方法和荧光定量PCR检测方法，该肝癌中环状RNA-MET基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术通过设计能扩增环状RNA的特异性引物，PCR扩增出来MET基因的环状RNA，通过PCR产物克隆DNA测序的方法测定出来了环状RNA-MET的准确的环化位点；确定了MET基因客观存在一种由1214个核苷酸组成的环状RNA。本发明专利技术通过肝癌中环状RNA-MET基因的荧光定量PCR检测方法；能够特异性检测肝癌细胞和肝癌临床组织标本中的环状RNA-MET的存在及表达性差异；本发明专利技术可以为肝癌的早期临床诊断提供一种理想的基因检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种肝癌中环状RNA-MET基因及其表达方法 和荧光定量PCR检测方法；为肝癌的早期诊断和分类提供基础。
技术介绍
生物体内的环状RNA (circRNA)是一类具有特殊未知功能的RNA，而且是客观大量 存在的。环状RNA由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成，以前的研究由 于技术水平的限制，把这部分客观存在的RNA忽略了，随着深度RNA测序及规模化生物信息 技术的发展，研究者才真正发现在生物体内大量存在环化的RNA分子，环化RNA由于形成闭 合的环状，在生物体内非常的稳定。对于环化RNA的具体功能尚未有明确，目前只有几种假 定的说法1)环状RNA可以作为"sponge"海绵吸miRNA，抑制其功能2) circRNA通过碱基互 补配对直接调控其他RNA水平3) circRNA能与蛋白质结合，抑制蛋白质活性、募集蛋白质 复合体的组分或调控蛋白质的活性4)circRNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成。 MET 基因又叫 HGFR(hepatocyte growth factor, HGF)，肝脏细胞生长因子受体， 其作用是促进肝脏细胞及一些内皮细胞的分裂生长，在肝癌的发生发展过程中具有重要作 用。通过环状RNA专门数据库（ http://circrna.org/)检索发现MET基因的RNA存在环化 现象；然而，目前在这一领域并没有更深入的研究。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种肝癌中环状RNA-MET基 因，从肝癌细胞中PCR扩增环状的RNA-MET，通过克隆测序的方法准确确定了环状RNA-MET 环化位点。 为解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下： 肝癌中环状RNA-MET基因，该肝癌中环状RNA-MET基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 所示。 进一步的，上述方案中，PCR扩增所述肝癌中环状RNA-MET基因的引物为： 上游引物：5'CCAGATTCTGCCGAACCAATG 3' 下游引物：5，GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'。 肝癌中环状RNA-MET蛋白，该肝癌中环状RNA-MET蛋白结构为SEQ ID NO: 1所示 的1214个核苷酸首尾相接形成环状的分子。 本专利技术的另一目的在于提供一种肝癌中环状RNA-MET基因的表达方法，通过设计 能扩增环状RNA的特异性引物，PCR扩增出来MET基因的环状RNA，通过PCR产物克隆DNA 测序的方法测定出来了环状RNA-MET的准确的环化位点；确定了 MET基因客观存在一种由 1214个核苷酸组成的环状RNA。具体方案如下： 肝癌中环状RNA-MET基因的表达方法，该表达方法包括以下步骤： 1)提取细胞或组织中的总RNA :提取肝癌细胞或肝癌组织中的总RNA ; 2)除去提取的RNA中残留的基因组DNA :在上述提取的总RNA中加入反应液，经过 消化、灭活后除去残留的基因组DNA ; 3)将RNA逆转录成cDNA :在PCR管中加入上述RNA作为模板、采用随机逆转录引 物，在PCR体系中逆转录成cDNA ; 4)引物设计及PCR扩增克隆测序 设计 PCR 扩增引物，引物序列为 MET-F:5' CCAGATTCTGC CGAACCAA TG 3'， MET-Rl: 5' GCTCCTCTGCACCAAGGTAA3' ；选取β -actin基因为内参基因，作为荧光定量结 果数据的矫正基因，序列如下：β-actin F:5'GC ATGGGTCA GAAGGATTCCT 3'，β-actin R: 5' TCGTCCCAGTTGGTGACGA T 3' ；然后用 PCR扩增环状 RNA-MET，电泳检测 PCR产物，将 PCR 产物克隆到PMD18-TA克隆载体中，然后DNA测序鉴定；用上述引物进行PCR反应，反应完取 PCR产物电泳；将PCR产物切胶回收，使用胶回收试剂盒回收纯化，然后用T4连接酶将目标 片段连接到PMD18-TA克隆载体中，再将产物转化到DH5a大肠杆菌，过夜培养；第二天挑取 单克隆做DNA测序鉴定，PCR产物克隆测序显示RNA-MET的第二个外显子1214bp通过首尾 相连发生了环化，即cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的环状RNA-MET基因。 进一步的，上述表达方法所述的步骤1)中具体按照以下步骤提取总RNA : (a)肝癌组织取2mg大小的组织块，组织用液氮研磨至粉碎，转移到I. 5ml离心管， 加入1ml trizol ;肝癌细胞取100万个左右的细胞，加入1ml trizol ; (b)加入200 μ L氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置15min ; (c)4°C下，12, OOOg离心15min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另 一个新的 RNase free EP 管； (d)加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀； &)4°(：下，12,00(^离心1〇1^11，离心后管底出现1?熟沉淀，弃去上清； (f)加入1ml 75%乙醇，用手轻轻颠倒，12, OOOg离心5min，弃去上清； (g)室温晾干，加入20 μ L DEPC水溶解沉淀。 进一步的，上述表达方法所述的步骤2)中的反应液总体积为20 μ L，由如下组分 组成： RN4 _L DNase I 10 x buffer 2pL H20(RNase free) IO1UL; 步骤I)提取的提取的总RNA在上述反应液中于37°C消化30min后，加入0. 5 μ I EDTA，65°C灭活10min。 进一步的，上述表达方法所述的步骤3)中逆转录的PCR体系为： RNase free ddH20 up to 1 补足至 10 μ L ; 反应条件为：25°C 5min，42°C 20min，85°C 5min，4°C 2min。 进一步的，上述表达方法所述的步骤4)中PCR扩增环状RNA-MET反应体系为： 2XPCR MIX 15yL，10mM上下游引物各1.5yL，！fepG2肝癌细胞cDNA模板lyL，用灭菌水 补足3(^1^体系；反应条件为：95 1€51^11预变性，循环内95°(：158变性，6〇1€3〇8退火，721€ 延伸30s，共35个循环，PCR反应循环后72°C继续延伸7min，然后16°C保存。 进一步的，上述表达方法所述的步骤4)中用T4连接酶将目标片段连接 到PMD18-TA克隆载体中连接体系是：PCR产物4yL，TA载体lyL，T4连接酶lyL， 10XT4buffer I yL，无菌水 3 yL, 16°C反应 30min。 本专利技术的第三个目的在于提供一种肝癌中环状RNA-MET基因的荧光定量PCR检测 方法；能够特异性检测肝癌细胞和肝癌临床组织标本中的环状RNA-MET的存在及表达性差 异；本专利技术可以为肝癌的早期临床诊断提供一种理想的基因检测方法。 肝癌中环状RNA-MET基因的荧光定量检测方法，该荧光定量检测方法包括以下步 骤： 1)提取总RNA :提取肝癌细胞或肝癌组织中的总RNA ; 2)除去提取的RNA中残留的基因组DNA :在上述提取的总RNA中加本文档来自技高网...
【技术保护点】
肝癌中环状RNA‑MET基因，其特征在于，该肝癌中环状RNA‑MET基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：缪辉来，张茂雷，
申请(专利权)人：广州吉赛生物科技有限公司，广东医学院附属医院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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