一种环状RNA的鉴定方法技术

本发明专利技术涉及环状RNA检测领域，特别涉及一种环状RNA的鉴定方法，包括以下步骤：准备待测RNA；将RNA反转录为cDNA；该待测RNA以环状RNA的形式设计2对以上引物以扩增整个待测RNA的基因序列，并且不同引物扩增得到的基因片段的首尾之间均有重合碱基；用不同引物分别对cDNA进行PCR扩增；对扩增得到的产物进行检测，即可判断是否为环状RNA。本发明专利技术提供的环状RNA的鉴定方法，通过设计引物使得扩增的片段的首尾之间相互重合部分碱基，从而根据扩增得到的基因片段来判别是否为环状RNA，该方法可以用于大规模鉴定环状RNA，方法简单，成本较低，周期短，且鉴定的准确率较高，基本不会出现假阳性的情况。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及环状RNA检测领域，具体而言，涉及一种环状RNA的鉴定方法。
技术介绍
环状RNA是一类广泛存在于动植物体中的一类非编码RNA，于上个世纪70年代首 次发现RNA的类病毒中，由于生物信息学等技术的限制，起初人们以为这是RNA转录过程中 错误剪接而形成的低丰度的副产物，便没有对其进行系统的研究。随着RNA测序技术及生 物技术的快速发展，人们日渐发现人类的许多外显子转录本可以被反向剪接或者通过重排 等手段形成环状RNA，而且进一步发现环状RNA的含量远超出人们的想象，在总RNA中占了 相当大的比例。通过人们深入的研究，环状RNA的生物学功能及其在疾病，生长发育过程中 的作用正逐渐被揭示。已有部分研究表明环状RNA可以充当miRNA的海绵，与miRNA结合， 竞争性的抑制miRNA的作用，从而调控mRNA发生作用。更有研究表明环状RNA可能发挥与 mRNA相似的作用来来调控蛋白的合成。在疾病发生过程中，有研究表明环状RNA可以作为 疾病发生的生物指标，如在胃癌组织中，Hsa_ CirC_002059的含量相较于正常组织会有较大 的降低。因此可以作为一项检测指标来判别疾病的发生。因此，对环状RNA的鉴定和研究 显得尤为重要。目前，环状RNA的鉴定主要采用以下方法：1.先确定环状RNA的连接点（即剪接 位点）；2.在连接点两端设计引物，然后进行PCR扩增；3.将PCR扩增产物进行测序，如果 所扩增的序列中含有连接点序列，则证明此序列为环状RNA，否则不是。但该方法的主要缺 点是：首先要确定环状RNA的连接点，然后才能设计引物。而连接点的确定通常是由计算机 预测出来的，准确度低，而且一个环可能被预测出有多个连接点，因此，这种方法的准确性 不尚。 另外，还有以下检测方法：如RNase R法，使用这种方法操作繁琐，首先要去除RNA 中的rRNA，其次还要将剩余的RNA进行RNase R酶处理，处理完后还要对对剩余RNA进行纯 化，再进而对产物进行定量分析，比较酶解前后RNA含量的变化，从而确定该RNA是否为环 状RNA，这种方法繁琐，费用较高，而且鉴定出来的假阳性率较高。因为过高的RNaseR酶浓 度可以降解部分环状RNA，而且部分高度结构化的线状RNA对RNaseR酶具有一定的抵抗作 用，不易被其降解。另外，Northern blot法，其方法本身就是不明确的，因为环状RNA在胶 中的运动情况取决于胶的种类，环状RNA的大小、RNA的结构，因此其不能准确确定其是否 为环状，而且这种方法也不能大规模的来鉴定环状RNA。 有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种环状RNA的鉴定方法，所述的方法可以用于大规模的 鉴定环状RNA，方法简单，成本较低，周期短，且鉴定的准确率较高，基本不会出现假阳性的 情况。 为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案： -种环状RNA的鉴定方法，包括以下步骤： (a)、准备待测 RNA; (b)、将所述RNA反转录为cDNA ; (c)、该待测RNA以环状RNA的形式设计2对以上引物以扩增整个待测RNA的基因 序列，并且不同引物扩增得到的基因片段的首尾之间均有重合碱基； (d)、用不同引物分别对cDNA进行PCR扩增； (e)、对扩增得到的产物进行检测，即可判断是否为环状RNA。 本专利技术提供的一种环状RNA的鉴定方法，主要用于环状RNA的快速鉴定。现有环 状RNA的鉴定方法如RNase R法，这种方法繁琐，费用较高，而且鉴定出来的假阳性率较高； 而Northern blot法，其方法本身就是不明确的，而且这种方法也不能大规模的来鉴定环状 RNA。本专利技术提供的环状RNA的鉴定方法，通过设计引物使得扩增的片段的首尾之间相互重 合部分碱基，从而根据扩增得到的基因片段来判别是否为环状RNA，该方法可以用于大规模 鉴定环状RNA，方法简单，成本较低，周期短，且鉴定的准确率较高，基本不会出现假阳性的 情况。 根据待测RNA的基因序列的长度，以环状RNA的形式设计不同数目的引物对，不同 的引物对cDNA进行PCR扩增，若每对引物均能得到相应的目的片段，则证明该待测RNA为 环状RNA。 以环状RNA的形式设计不同数目的引物对即将已知序列的RNA片段先形成环，然 后根据环状随机设计引物。 优选地，所述待测RNA的基因序列长度不大于400bp，所述引物设计2-3对。 进一步地，所述待测RNA的基因序列长度大于400bp，所述引物设计3对以上。 优选地，所述待测RNA的基因序列长度在300bp-500bp，所述引物设计3对。 优选地，在步骤（e)中，所述对扩增得到的产物进行检测为： 通过电泳检测扩增产物片段的大小，来判断是否为环状RNA。 即通过检测每对引物均能得到其目的片段，则证明该待测RNA为环状RNA ;同样 地，若是不是所有的引物都能得到其目的片段，这证明该待测RNA不是环状RNA。 进一步地，在步骤（e)中，所述对扩增得到的产物进行检测还包括： 将扩增得到的产物进行测序，通过序列比对来判断是否为环状RNA。 即通过对扩增得到的目的片段进行测序，测序所得序列与已知的待测RNA的基因 序列比对，进一步验证其是否为首尾连接，从而判断其是否为环状。 为了便于检测，优选地，每对引物扩增出来的基因片段大于100bp。 进一步地，每对引物扩增出来的基因片段在150_300bp之间。 优选地，所述重合碱基的个数为5bp_80bp。如重合碱基的个数根据设计的引物需 求，可选择不同的重合碱基个数，如可以为5bp、10bp、15bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、 70bp、80bp 等等。 优选地，所述重合碱基的个数为10bp_50bp。 本专利技术提供的环状RNA的鉴定方法，是将对环状RNA的鉴定转化为对其反转成的 cDNA进行鉴定，通过特异性引物的设计，对PCR产物的检测来鉴定是否为环状RNA。 与现有技术相比，本专利技术的主要创新点如下： 1.将环状RNA反转为cDNA，从而将对环状RNA的研究转化为对DNA的研究，方便 后续工作的开展； 2.根据环状RNA的长度来确定引物的对数，通常400bp以内的设计2-3对引物， 400bp以上的设计3对及以上引物； 3.弓丨物设计的原则。几对引物扩增的产物首尾之间要有重复序列，能够相互连接 起来，以便形成一个完整的环； 4.PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若为一个环状RNA所设计的引物都能扩增出其 所预计大小的片段，则可将产物进行测序处理； 5.通过序列的比对，看序列之间是否能相互连接成环状，来最终确定其是否为环 状 RNA〇【附图说明】 为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。 图1为本专利技术实施例1引物设计的原则示意图； 图2为本专利技术实施例2中PCR产物电泳图； 图3为本专利技术实施例2中由引物1进行的PCR扩增产物与已知序列进行比对的示 意图； 图4为本专利技术实施例2中由引物2进行的PCR扩增产物与已知序列进行比对的示 意图； 图5为本专利技术实施例2中由引物3进行的PCR扩增产物与已知序列进行比对的示 意图； 图6为本专利技术实施例3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环状RNA的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)、准备待测RNA；(b)、将所述RNA反转录为cDNA；(c)、该待测RNA以环状RNA的形式设计2对以上引物以扩增整个待测RNA的基因序列，并且不同引物扩增得到的基因片段的首尾之间均有重合碱基；(d)、用不同引物分别对cDNA进行PCR扩增；(e)、对扩增得到的产物进行检测，即可判断是否为环状RNA。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐中林，钮广林，李奎，化朝举，范新浩，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11