本发明专利技术提供了一种人组织激肽释放酶-1（hK1）编码基因、表达纯化方式和活性检测方法，以及一种改良的毕赤酵母发酵BSM培养基。本发明专利技术优化后的人激肽释放酶-1编码基因如SEQ ID NO:1所示。该序列是针对毕赤酵母表达系统进行密码子优化得到的序列，与天然序列相比，其更利于hK1在毕赤酵母中表达；建立的荧光酶活测定方法操作简单，并可应用于高表达单克隆重组工程菌的筛选。此外，改良发酵BSM培养基可在不影响毕赤酵母生产的前提下，促进hK1蛋白的高效表达，且抑制宿主内源蛋白的表达，便于下游分离纯化。由此可见，本发明专利技术为hK1蛋白在毕赤酵母中的表达应用奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程基因领域，涉及一种人激肽释放酶-1，编码基因、表达纯化方 式和活性检测方法及其应用。
技术介绍
激肽释放酶（也称为激肽原酶）是一种丝氨酸蛋白酶，能使激肽原释放出激肽， 它具有很高的生理活性，在人体组织中起着十分重要的生理作用。激肽释放酶主要分为两 类：血楽激肽释放酶（PlasmaKallikrein，PK)和组织激肽释放酶（TissueKallikrein， TK)。两种酶在分子量大小、底物特异性、免疫学特征和释放出的激肽方面不尽相同。血浆 激肽释放酶可参与血凝块的表面激活、纤维蛋白溶解、激肽生成和炎症过程。而组织激肽释 放酶广泛存在于肾、胰腺、胃肠道黏膜及中枢神经系统等许多组织中，它以激肽原酶原的形 式在组织中合成，再经胰蛋白酶激活形成组织激肽释放酶，并可释放至血液循环。组织激 肽释放酶基因是一类大的多成员家族，目前证明人组织激肽释放酶家族至少由15个成员 (KLK1-KLK15)组成。目前，组织激肽释放酶已应用于临床，用于糖尿病并发症、高血压及急性缺血性脑 卒中等疾病的治疗。较为常见的产品主要有两类：一类是从猪胰脏提取的激肽释放酶(例如 常州千红制药的"怡开")，是以来源比较广泛的猪胰脏为原料提取纯化而得的组织激肽释 放酶KLK1。但是，从猪胰脏中提取和纯化猪激肽原酶的过程繁琐且提取量低，且由于种属 差异，动物源活性蛋白在人体内易产生免疫反应。另一类是人尿激肽释放酶(例如广州天普 的"凯力康")，其主要由人尿中提取，虽然人尿激肽释放酶生物活性明显高于猪胰脏激肽释 放酶，并消除了动物来源蛋白免疫原性的问题，但是依然面临来源有限、易受病毒污染等问 题。因此重组人组织激肽释放酶(Homosapienskallikreinl，hKl)蛋白的高效制备显 得极为迫切，而要获得高效价廉的重组hKl蛋白，须通过基因工程技术大量制备和生产，才 有可能应用于实际的生产中。 迄今为止，国内外采用基因工程的方法利用酵母表达系统生产重组hKl蛋白进行 了不少研究，但由于种属差异，hKl天然序列很难直接在酵母中表达，表达产物常出现序列 不正确、糖基化修饰均一度差、生物活性低、产量低或生产工艺复杂、涉及有毒试剂难以产 业化应用等问题。例如，1998年Chan等得到的重组hKl蛋白电泳时显示两条带，且无法证 明产品均一性（ProteinExpressionandPurificationl2, 361 - 370,1998) ;2004 年袁新 清等得到的重组hKl产量仅约40mg/L(人胰激肽原酶在毕赤酵母中的分泌表达，袁新清陈 劲春，北京化工大学生命科学与技术学院，Vol. 31，No. 6, 2004)。另外根据中国专利申请 200610027754. 1可知，2006年上海万兴生物研发的毕赤酵母表达重组hKl蛋白工艺，宿主 内源蛋白表达量高，hKl分离纯化困难；并且其工艺中采用甲醇作为诱导剂，而甲醇为危险 有机试剂，不仅成本提高、存在安全隐患，而且在蛋白后期纯化中也可能面临甲醇残留等问 题。另外，上海万兴生物以Panomics公司的人肾cDNA文库为模板，用PCR法获得了人hKl 的基因，其162位点上可能存在Glu/Lys两种氨基酸，这种氨基酸的多态性及酵母表达糖修 饰的多样性导致了产品的不均一。其次，目前检测hKl的活性方法主要是利用hKl特异性 水解发色底物S-2266 (Val-Leu-Arg-pNA)分子中-Arg-pNA之间的化学键而释放出pNA，利 用游离的PNA在A405值来比较活性的大小，但是培养基以及毕赤酵母内源蛋白的表达导致 的背景很高，从而使得该测活方案准确度很低。 除此之外，上海万兴生物在培养毕赤酵母表达重组hKl时采用的是工业上常用的 发酵培养基BSM，该培养基中含有很高的盐浓度，当pH>5以上，BSM培养基中会产生很多沉 淀，不利于菌体生长；而且培养基中的盐浓度过高，导致高渗透压引起发酵过程中导致细胞 自溶产生脂类物质和增加外源DNA残留的几率，为后续下游纯化等工作带来很多麻烦，并 易使表达的蛋白发生沉淀。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足之处，本专利技术提供了一种生产工艺更简单、产量更 高，并且表达产品更均一的表达系统及与之相适应的表达基因，以及hKl的测活方法和纯 化方法。 本专利技术的一个目的是提供一种重组hKl蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。 本专利技术的另一个目的是提供一种编码上述所述重组hKl蛋白的基因，其碱基序列 如SEQ ID NO: 1所示。该序列是针对毕赤酵母表达系统进行密码子优化得到的序列，与天 然序列相比，其更利于hKl在毕赤酵母中表达。 优选的，本专利技术还在上述所述编码重组hKl基因之前加入分泌信号肽，优选地，本 专利技术的分泌信号肽序列是专为毕赤酵母分泌表达到细胞外的信号肽；更优选地，本专利技术的 分泌信号肽序列是针对毕赤酵母表达系统优化得到的信号肽序列，相比之下显著提高异源 基因在宿主菌中的分泌效率。优化后的分泌信号肽的碱基序列如SEQ ID N0:3所示。 本专利技术的另一个目的是提供一种含有上述编码重组hKl的基因或带有分泌信号 肽的编码重组hKl的基因的载体，优选的，所述的载体为pA0815,pPIC9,pPIC9K，pPIC3. 5， pPIC3. 5K，pPICZaA、B、C或pGAPZaA、B、C，更优选为pPIC3. 5K，pPICZaA或pGAPZaA。 本专利技术的另一个目的是提供一种包含上述所述载体的毕赤酵母菌株，优选的，所 述毕赤酵母菌株为SMD1168、GS115、KM71、X-33或KM71H，更优选为KM71或X-33菌株。 本专利技术的另一个目的是提供一种重组hKl蛋白的表达方法，所述方法包含下述步 骤： A.构建含有上述所述编码重组hKl的基因或带有分泌信号肽的编码重组hKl的基 因的载体；B.将步骤A的载体线性化后转入毕赤酵母菌株中，并在合适的条件下培养； C?回收纯化蛋白质。 上述所述载体优选为pPIC3. 5K，pPICZaA和pGAPZaA。 上述所述毕赤酵母菌株优选为KM71或X-33菌株。更优选的，上述所述载体为pGAPZa，并且上述所述毕赤酵母菌株为X-33菌株。 本专利技术的另一个目的是提供一种重组hKl蛋白酶动力学活性检测方法，所述方法 包含下述步骤：A.首先将荧光底物Z-Phe-Arg-MCA溶于DMS0中，再用反应缓冲液稀释至反应浓 度；B.将含有hKl蛋白的培养基加入酶标板中，2复孔，再分别加入荧光底物 Z-Phe-Arg-MCA。振荡混匀后，设置激发波长为360-400nm，发射波长440-480nm，循环读板； C.以突光信号值为纵坐标，读板时间为横坐标，斜率为突光信号值和读板时间的 比值，算出各个孔的斜率，斜率越大hKl蛋白活力越高。 本专利技术提供的hKl酶动力学活性检测方法可以用于高通量筛选高表达hKl的单克 隆毕赤酵母工程菌株或者细胞株，灵敏度和准确度都优于化学发光方法。 本专利技术的另一个目的是提供一种重组hKl蛋白高效表达的发酵改良BSM培养基， 所述改良发酵BSM培养基配方及制备如下：改良发酵BSM培养基：甘油40g/L，H3P049mL/L，CaS04?2H本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人激肽释放酶1的编码基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马永，王安良，范宇，孙芳，马骏，章成昌，徐春林，陈晨，王耀方，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，常州京森生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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