【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及一种聚乙二醇羧酸衍生物的制备方法。
技术介绍
1、聚乙二醇(peg)修饰技术是降低蛋白质或多肽药物免疫原性，改善药物药代动力学及药效学性质最有效的方法之一，具有广阔的应用前景。目前，技术最成熟的聚乙二醇修饰方法是对多肽和蛋白质分子中赖氨酸氨基进行化学修饰。鉴于聚乙二醇的端羟基活性较小，一般利用化学反应在端羟基位置引入羧酸结构，形成聚乙二醇羧酸中间体，随后引入nhs基团形成高活性peg修饰剂。
2、药物的peg修饰对peg修饰剂的纯度要求较高。然而，在聚乙二醇羧酸中间体的制备阶段，所得羧酸中间体中往往存在未反应完全的聚乙二醇原料或其他副产物。实现羧酸中间体和未衍生的聚乙二醇的分离纯化是聚乙二醇修饰剂开发的关键技术之一。
3、中国专利技术专利cn108659227a公开了采用阴离子层析填料，辅助gfc监测实现y型聚乙二醇-乙酸纯化的方法，但该方法对纯化前样品的处理有较高的要求，适用范围受限。
技术实现思路
1、为克服现有技术的不足，本专利技术提供一种具有广泛适用性的聚乙二醇羧酸衍生物的纯化方法，以制备高纯度聚乙二醇羧酸衍生物。
2、本专利技术提供了一种聚乙二醇羧酸衍生物的制备方法，包括以下层析纯化步骤：
3、(a)层析柱准备：层析介质选用阴离子交换填料，接入层析设备；
4、(b)样品上样缓冲液配制：聚乙二醇羧酸衍生物样品干燥处理后，经纯化水溶解，稀释至适宜电导值；
5、(c)纯化
6、(d)层析纯化：将步骤(b)所得样品上样缓冲液泵入步骤(a)的层析柱中，接入步骤(c)纯化洗脱液，设置洗脱梯度，分别完成各组分的收集；
7、(e)样品提取：聚乙二醇羧酸衍生物从步骤(d)所得收集液中分离提取。
8、作为优选，在层析纯化步骤(a)中，层析填料选用deae、q sepharose big beads(简称qbb)、qae等阴离子交换剂，本实施例中优选qbb填料，纯化效率更优。层析设备优选自动过柱机、蛋白纯化仪等，本实施例中优选自动过柱机。
9、在层析纯化步骤(b)中，聚乙二醇羧酸衍生物分子量优选2000～20000da。为使聚乙二醇羧酸衍生物与层析填料有效结合，上样溶液电导值应进行适当控制，优选地，电导值低于300μs/cm，更优选电导值低于150μs/cm。
10、进一步地，聚乙二醇羧酸衍生物上样缓冲液在层析纯化前应进行过滤以除去不溶物，优选地，采用0.22μm、0.45μm、1.0μm水系滤膜。
11、作为优选，在层析纯化步骤(c)中，纯化洗脱液选用易挥发性离子盐水溶液，离子盐类型为碳酸氢铵、碳酸铵、乙酸铵、甲酸铵等。本实施例中优选碳酸氢铵。盐浓度优选50mm～1m，更优选50mm～300mm，更优选100～200mm。
12、层析纯化步骤(d)根据聚乙二醇羧酸衍生物的结构类型，分为以下几种层析纯化方法：
13、1、直链型单羧基化聚乙二醇衍生物(通式(1)、通式(2))
14、
15、直链型单羧基化聚乙二醇衍生物粗品中通常存在未活化的聚乙二醇原料，通过柱层析能有效去除直链型聚乙二醇羧酸衍生物粗品中残留的聚乙二醇原料。上样后，优选纯化水或低浓度(洗脱梯度0～5％)洗脱液，完成残留直链型聚乙二醇组分的分离。随后调整洗脱梯度，优选5-20％洗脱梯度，完成直链型单羧基化聚乙二醇衍生物组分的分离。
16、2、直链型双取代聚乙二醇羧酸衍生物(通式(3)、通式(4))
17、
18、直链型双取代聚乙二醇羧酸衍生物粗品中通常存在未活化的聚乙二醇原料以及未完全活化的单取代聚乙二醇羧酸副产物。通过柱层析主要区分直链型聚乙二醇、单取代聚乙二醇羧酸、双取代聚乙二醇羧酸三个组分。上样后，优选纯化水或低浓度(洗脱梯度0～5％)洗脱液，完成聚乙二醇组分的分离。随后调整洗脱梯度，优选5～10％洗脱梯度，完成直链型单取代聚乙二醇羧酸组分的分离。最后，优选10～100％洗脱梯度，完成直链型双取代聚乙二醇羧酸组分的分离。
19、3、支链型聚乙二醇羧酸衍生物(通式(5))
20、
21、支链型聚乙二醇羧酸衍生物粗品中通常存在过量投料的直链型聚乙二醇羧酸前体(分子量约为支链型聚乙二醇羧酸的1/2)。通过柱层析主要区分直链型聚乙二醇羧酸、支链型聚乙二醇羧酸两个组分。上样后，优选5～20％洗脱梯度，完成支链型单羧基化聚乙二醇组分的分离。最后，优选20～100％洗脱梯度，完成直链型单羧基化聚乙二醇组分的分离。
22、通式(1)、通式(2)、通式(5)为单取代聚乙二醇羧酸衍生物，通式(3)和通式(4)为双取代聚乙二醇羧酸衍生物。通式(1)～(4)为直链型结构，通式(5)为支链型结构。
23、其中，n介于45～455间的整数，m是介于1～5之间的整数。
24、r1为连接基团，选自—(ch2)i—，其中，i为2～8之间的整数。
25、进一步地，层析纯化步骤(d)实施过程中，采用蒸发光散射检测器(elsd)对洗脱流程进行监测。例如在某些实施例中，以elsd信号值超过20mv开始收集，elsd信号值低于20mv停止收集。在某些实施例中elsd信号值超过50mv开始收集，elsd信号值低于50mv停止收集。
26、层析纯化步骤(e)的目的是完成聚乙二醇衍生物从水相收集液中的提取，任何已知的提取方式均可用于此，而不限于本申请中描述的方法。
27、具体的实施例例举了通式(1)-(5)所示聚乙二醇羧酸衍生物采用本申请的制备方法，均能获得高纯度产物，证明本申请的制备方法通用性强，适用于多种不同类别聚乙二醇羧酸衍生物，而不局限于实施例例举的聚乙二醇羧酸衍生物。
28、本专利技术提供的聚乙二醇羧酸衍生物的分离方法，所得聚乙二醇羧酸衍生物纯度高(＞99％)，收率高(＞90％)。步骤简单，通用性强，利于工艺放大和商业化生产，具有广阔的应用前景。
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1.聚乙二醇羧酸衍生物的制备方法，包括以下层析纯化步骤：
2.权利要求1所述的聚乙二醇羧酸衍生物的制备方法，层析纯化步骤(b)中上样溶液电导值低于300μS/cm，优选电导值低于150μS/cm。
3.权利要求1所述的聚乙二醇羧酸衍生物的制备方法，层析纯化步骤(c)中，纯化洗脱液选用易挥发性离子盐水溶液，离子盐类型为碳酸氢铵、碳酸铵、乙酸铵或甲酸铵，优选碳酸氢铵；盐浓度优选50mM～1M，更优选50mM～300mM，更优选100～200mM。
4.权利要求1所述的聚乙二醇羧酸衍生物的制备方法，层析纯化步骤(d)采用蒸发光散射检测器(ELSD)对洗脱流程进行监测。
5.权利要求1所述的聚乙二醇羧酸衍生物的制备方法，当聚乙二醇羧酸衍生物为直链型单羧基化聚乙二醇衍生物(通式(1)、通式(2))，n是45～455间的整数，m是1～5之间的整数，i为2～8之间的整数，
6.权利要求1所述的聚乙二醇羧酸衍生物的制备方法，当聚乙二醇羧酸衍生物为直链型双取代聚乙二醇羧酸衍生物(通式(3)、通式(4))，n是45～455间的整数，m是1～
7.权利要求1所述的聚乙二醇羧酸衍生物的制备方法，当聚乙二醇羧酸衍生物为支链型聚乙二醇羧酸衍生物(通式(5))，n是45～455间的整数，m是1～5之间的整数，R1为—(CH2)i—，i为2～8之间的整数，
...【技术特征摘要】
1.聚乙二醇羧酸衍生物的制备方法，包括以下层析纯化步骤：
2.权利要求1所述的聚乙二醇羧酸衍生物的制备方法，层析纯化步骤(b)中上样溶液电导值低于300μs/cm，优选电导值低于150μs/cm。
3.权利要求1所述的聚乙二醇羧酸衍生物的制备方法，层析纯化步骤(c)中，纯化洗脱液选用易挥发性离子盐水溶液，离子盐类型为碳酸氢铵、碳酸铵、乙酸铵或甲酸铵，优选碳酸氢铵；盐浓度优选50mm～1m，更优选50mm～300mm，更优选100～200mm。
4.权利要求1所述的聚乙二醇羧酸衍生物的制备方法，层析纯化步骤(d)采用蒸发光散射检测器(elsd)对洗脱流程进行监测。
5.权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：许振，马永，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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