本发明专利技术涉及检测人组织激肽释放酶1(hK1)ELISA定量检测试剂盒及其相关抗体。本发明专利技术制备了多种单克隆抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合(A24及A32)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能都较好的人组织激肽释放酶1的酶联免疫定量检测试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫化学
，具体的涉及检测人组织激肽释放酶1(hK1)ELISA定量检测试剂盒及其相关抗体。
技术介绍
心脑血管疾病是严重危害人类健康的主要慢性非传染性疾病。其中冠心病及脑卒中是世界上最常见的死亡原因。在我国，随着人口的老龄化，以冠心病，脑卒中为代表的心脑血管疾病的发病率，致死率及致残率呈逐年上升的趋势。但是，80％的脑卒中是可以预防的。糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症，严重危害糖尿病患者的生命质量和医疗消费质量。若不从循证医学的高度采取积极的干预措施，糖尿病肾病就会在较短的时间内发展为不可逆转的终末期肾病，严重威胁患者的生存寿命。因此，积极寻找有效的方法，早期诊断脑卒中、糖尿病肾病以进行有效的防护直接关系着患者的生命质量及生存寿命。激肽释放酶－激肽系统(kallikrein-kinin system，KKS)又称激肽系统，广泛存在于动物体内的多个系统，尤其是在心血管系统内分布更为密集。该系统有广泛生物学活性，并且和凝血系统、肾素-血管紧张素系统以及多种血管活性因子系统等存在密切的联系和交叉对话，共同维护人体多器官正常的生理机能和参与各种复杂的病理生理过程，具有调节心血管、肾脏、神经系统和葡萄糖代谢，舒张血管、参与炎症反应、疼痛刺激和休克反应。近年来关于激肽系统的临床研究主要集中在心血管、肾脏、中枢神经系统疾病中的作用。人组织激肽释放酶是激肽系统最重要的组成部分，是一组分泌型丝氨酸蛋白酶，包含15个成员。在所有已知的组织激肽释放酶中，只有人组织激肽释放酶1(胰/肾激肽释放酶，Human kallikrein 1，hK1，KLK1，又称激肽原酶，Kininogenase)能有效水解低分子量激肽原(LMWK)，释放具有活性的激肽，进而发挥心血管系统及肾脏功能的调节作用。基础研究表明，在多种高血压动物模型中已证实，hK1具有降低血压，减轻肾脏和心脏肥大及纤维化的作用；其在进行心脏重塑，减轻肾脏损害，降低脑梗死发生率以及降低神经损伤危害等方面的作用。同时，通过外源性给药的方法，亦证明了hK1在防止中风，心脑血管以及肾脏疾病方面的作用。近些年来，进一步的研究表明，hK1水平在人的心脑血管疾病的发生发展的过程中具有重要的临床意义，可能作为预测脑卒中发病率的指标。hK1水平可预测脑卒中的发病及五年无事件性生存率，可让患者早期预防并采取相应的措施，从而一定程度上降低脑卒中的发生概率。另外，hK1较尿微量白蛋白排泄率可更早的诊断早期糖尿病肾病。综上可
见，hK1的水平对于人的心脑血管疾病及糖尿病肾脏疾病具有重要的预测价值。因此，准确测定hK1的水平，在临床及科研中均具有重要的意义。鉴于hK1在心脑血管疾病及糖尿病肾脏疾病中的治疗及预测作用，制备hK1定量检测试剂盒具有重要临床的应用价值。国内外已有hK1科研用定量检测试剂盒：其中部分试剂盒采用竞争法，抗体为多克隆抗体，其操作繁杂，计算繁琐且易出现非特异性结合而导致检测结果误差较大；部分试剂盒采用多克隆抗体的夹心法检测模式，亦存在非特异性结合的影响；另外一些试剂盒采用多克隆抗体及单克隆抗体的双抗体夹心的模式，其检测性能有待进一步验证。双抗体夹心法的检测模式可有效避免上述问题。因此，多表位，高灵敏度，特异性的抗体的制备是高质量的人组织激肽释放酶1定量检测试剂盒的关键因素之一。天然hK1存在多个糖基化位点，因而重组表达hK1在糖基化位点等其他构象方面可能与天然蛋白存在较大的差异。在特异性抗体筛选时采用重组hK1进行筛选就会出现筛选的特异性抗体不能有效识别天然hK1的问题。本专利技术采用人天然hK1进行抗体的筛选工作，可有效避免上述情况的发生，且已证实其与天然hK1的结合力。同时，为满足市场的不同应用需求，本专利技术制备了三种hK1定量检测试剂盒：人组织激肽释放酶1ELISA定量检测试剂盒，可满足一般小型综合医院的应用需求，且日后可发展升级为化学发光法定量检测(全自动)，满足大型综合医院的全自动检测的应用需求。人组织激肽释放酶1胶体金定量检测试纸卡及人组织激肽释放酶1荧光定量检测试纸卡，均可满足快速检测及床边检测的需求。其中胶体金定量检测法灵敏度和准确度虽不如荧光定量检测法，但其使用方便易于推广且成本较低，可基本满足疾病指标的定量检测，适合于基层医疗系统中的即时检测。荧光定量具备更高的检测灵敏度，适用于检测要求较高的检验中心或大型医院临床科室的床边诊断的应用需求。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供能有效的、特异性结合人组织激肽释放酶1的抗体。更具体地说：本专利技术的第一目的在于提供两种抗人组织激肽释放酶1抗体。第一种抗人组织激肽释放酶1抗体(A24)，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。优选的是本专利技术中的抗体A24的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。第二种抗人组织激肽释放酶1抗体(A32)，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：12所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3。优选的是本专利技术中的抗体A32的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。本专利技术第二个目的是提供两种单链抗体，所述单链抗体A24的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；所述单链抗体A32的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。优选的，所述单链抗体A24、A32中不含由六个组氨酸构成的HIS标签。本专利技术第三个目的是提供两种编码上述单链抗体的核苷酸序列，编码单链抗体A24的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，和编码单链抗体A32的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。本专利技术第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。本专利技术第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主细胞。所属宿主细胞可以是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞，优选为毕赤酵母。本专利技术第六个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：1)在合适的条件下培养上述重组宿主细胞表达抗体；2)然后从宿主细胞中纯化、收集抗体。本专利技术的第七个目的在于提供上述抗人组织激肽释放酶1抗体在检测人组织激肽释放酶1含量中的应用。本专利技术的第八个目的在于提供一组可进行配对并检测人组织激肽释放酶1的抗体对组合；该抗体对组合的检测灵敏度高，特异性好。本专利技术的第九个目的在于提供一种利用所述抗人组织激肽释放酶1抗体检测人组织激肽释放酶1的酶联免疫定量检本文档来自技高网...
【技术保护点】
人组织激肽释放酶1的酶联免疫定量检测试剂盒，包括包被了抗体A24或A32的酶标板、样品稀释液、标准品、含有酶标抗体A32或A24的检测液、洗涤液、显色液及终止液；所述抗体A24是抗人组织激肽释放酶1抗体，包括：重链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；以及其轻链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3；所述抗体A32是抗人组织激肽释放酶1抗体，包括：重链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；以及其轻链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQ ID NO：12所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3。...
【技术特征摘要】
1.人组织激肽释放酶1的酶联免疫定量检测试剂盒，包括包被了抗体A24或A32的酶标板、样品稀释液、标准品、含有酶标抗体A32或A24的检测液、洗涤液、显色液及终止液；所述抗体A24是抗人组织激肽释放酶1抗体，包括：重链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；以及其轻链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3；所述抗体A32是抗人组织激肽释放酶1抗体，包括：重链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；以及其轻链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQ ID NO：12所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3。2.根据权利要求1所述的人组织激肽释放酶1的酶联免疫定量检测试剂盒，其特征在于所述抗体A24重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：马永，赵利利，杨芸，付红，徐春林，陈一飞，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，常州京森生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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