一种戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提供了一种戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针。本发明专利技术所提供的戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒具有很好的特异性，且操作快速、方法简便、检测范围宽，同时在反应体系中增加的内标能够有效防止检测呈假阴性。本发明专利技术所提供的戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒在提取RNA时使用吸附效果好、易于纯化的磁珠法，该法能够有效地去除复杂样本中的PCR抑制物，从而获得高纯度和高得率的RNA，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学检测
，更为具体地说，涉及一种戊型肝炎病毒荧光定量 PCR检测试剂盒及其使用方法。
技术介绍
戊型肝炎病毒OfepatitisEvirus，HEV)是戊型肝炎（以下简称"戊肝"）的病原 体，主要通过粪一口途径传播，在人群中可引起散发、暴发和流行。HEV在病毒学分类上属于 戊型肝炎科，哺乳动物HEV至少可分为4种基因型，即基因1型、2型、3型和4型HEV(以下 分别简称HEV-1、HEV-2、HEV-3和HEV-4)。通过研究发现各基因型具有明显的地域分布特 点：基因1型主要分布在亚洲和北非；基因2型主要分布在墨西哥及部分西非国家；基因3 型为全球分布，主要集中在欧美、日本等发达国家；基因4型则主要在我国和日本等亚洲国 家流行。HEV-1和HEV-2仅见于人，HEV-3和HEV-4为人畜共患型，可感染人、猪、鹿、猫等， 其中猪是其主要的动物宿主。 HEV是单股正链无包膜RNA病毒，病毒体呈球形，直径约为32-34nm。HEV基因组全 长约7. 2kb，5'端为戊基鸟嘌呤帽，3'端则为多聚腺嘌呤尾，包含三个部分重叠的开放阅读 框。0RF1临近5'末端，编码一个长度约为1693个氨基酸的非结构蛋白，该蛋白包含戊基 转移酶、木瓜样半胱氨酸激酶、MacroDomain、RNA解旋酶、RNA依赖的RNA聚合酶等多个病 毒复制所需的功能性结构域。0RF2位于3'末端，编码长度为660aa的病毒衣壳蛋白，该蛋 白N末端含有一个信号序列可以将其转运至细胞内质网进行糖基化修饰和病毒组装；研究 表明0RF2蛋白458-607位氨基酸含有HEV的中和表位。0RF3的绝大部分与0RF2重叠，编 码一个长度仅为114aa的蛋白，对于病毒后期形态形成和释放出胞具有至关重要的作用。 而目前在临床戊肝诊断的方法中，主要是采用基于实时荧光定量PCR(Polymerase ChainReaction，即聚合酶链式反应）的技术及其改进。实时荧光定量PCR技术是近年来 发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置 能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光 信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获 得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状，可以判 断阴阳性结果，并得知样本浓度的定值结果。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量 分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。但是，仅有极少量荧光PCR诊 断试剂盒在HEV诊断中使用，且缺乏完善的质控体系，操作比较繁琐，灵敏度不高，检测范 围小，因此，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确快速诊断的 需要。 国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测戊型肝炎病毒的方法，这些试 剂盒所提供的HEV-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法，然而酚-氯仿法和柱提取 法存在很多不足之处：1)酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和 人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无 需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差、准确度差；2)无法有效去除样 本中的PCR抑制物3)无法监控假阴性；4) 一般没有预防PCR产物污染的措施；5)现有方法 检测灵敏度欠佳，可能出现漏检现象。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法， 以解决
技术介绍
所述的现有HEV检测方法准确度差的问题。 为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案： 本专利技术提供了一种戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括 PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、用于扩 增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针； 所述用于检测靶多核苷酸的探针的碱基对序列为： 5 'FAM-TGATTCTCAGCCCTTCGC-BHQ13 '。 优选地，所述用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的碱基对序列为： 优选地，所述检测试剂盒还包括内标，所述内标为插入PUC18T载体的一段长为 128碱基对的人工合成DNA序列的重组体，且所述128碱基对的序列为： 优选地，所述PCR反应液还包括用于检测内标的探针，所述检测内标的探针的碱 基对序列为： 5 'HEX-TCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACC-BHQ13 '。 优选地，所述PCR反应液还包括用于扩增内标的上游引物以及下游引物；所述上 游引物以及下游引物的碱基对序列为： 优选地，所述DNA聚合酶为1U/μ1~5U/μ1TthDNA聚合酶和1U/μ1~5U/μ1 H-TaqDNA聚合酶。 优选地，所述检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照是浓度为1.00~ 5. 00E+05copies/ml的HEV病毒基因体外转录RNA。 优选地，所述检测试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为阴性人造血清。 优选地，所述检测试剂盒还包括RNA洗脱液，所述RNA洗脱液包括0. 8~1. 2mol/ L的Tris-HCl和 0· 1 ~1.Omol/L的EDTA。 优选地，所述检测试剂盒还包括RT-PCR增强剂，所述RT-PCR增强剂为浓度是 100 ~500mmol/L的Mn(0Ac)2。 优选地，所述检测试剂盒还包括： RNA提取溶液I:由质量/体积比为0. 2%~1. 0%的十二烷基硫酸钠、体积/体积 比为1. 0%~4. 0%的曲拉通，0. 2mol/L~1.Omol/L的异硫氰酸胍、100~400μg/ml的磁 珠组成；RNA提取溶液II:浓度为100~300mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和浓度为 100~300mmol/L的氯化钠；所述RNA提取溶液II的pH为6. 5±0. 2 ; RNA提取溶液III :由体积/体积比为0. 1%~1. 0%的曲拉通、浓度为100~ 300mmol/L的氯化钠；RNA提取溶液IV:矿物油。 本专利技术还提供了一种戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，所述使 用步骤包括：S01:取体积比为1000-1200:1的RNA提取溶液I和内标，混和均匀并形成RNA提 取试剂I-mix，瞬时离心后备用；S02:取体积比为49:1的PCR反应液和RT-PCR增强剂，混和均匀并形成PCR-mix， 瞬时离心后备用；S03:在灭菌离心管中加入200μ1~1mlRNA提取溶液I-mix，加入100μ1~1ml 待测样本，震荡混匀，瞬时离心后备用；S04:在步骤S03瞬时离心后备用的溶液中加入50μ1~400μ1RNA提取溶液II， 震荡混匀，静置； S05 :静置结束后瞬时离心，并将灭菌离心管置于磁珠分离器上，缓慢将溶液吸出 弃用，磁珠备用； S06 :在备用的磁珠内加入400μ1~1ml的RNA提取溶液III和100μ1~500μ1 的RNA提取溶液IV，震荡混匀并瞬时离心，然后将灭菌离心管再次置于磁珠分离器上； S07 :上清液分为两层，将吸头插入灭菌离心管底部，从本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针；所述用于检测靶多核苷酸的探针的碱基对序列为：5’FAM‑TGATTCTCAGCCCTTCGC‑BHQ13’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：戴立忠，丁海，周雷，刘佳，邓中平，
申请(专利权)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43