酶原激活剂制造技术

本文中提供酶原激活分子如酶原激活肽，以及鉴定和使用这些酶原激活分子如酶原激活肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】酶原激活剂相关申请本申请要求35U.S.C.§ 119下2011年10月14日提交的临时美国申请N0.61/547，628、2012年5月17日提交的美国申请N0.61/648，470和2012年6月18日提交的美国申请N0.61/661，180的权益，其内容通过提述完整并入本文。专利
本文中提供酶原激活分子如酶原激活肽，以及鉴定和使用这些酶原激活分子(例如酶原激活肽)的方法。序列表本申请含有经由EFS-Web提交且通过提述完整并入本文的序列表。所述ASCII拷贝在 2012 年 10 月 10 日创建，名为 P4768Rlff0_PCTSequenceListing.txt，且大小为 66，227个字节。专利技术背景肝细胞生长因子(HGF)，亦称为分散因子(scatter factor)，是血纤维蛋白溶酶原相关的生长因子家族的成员，而且是细胞迁移、增殖、存活、活动和形态发生的关键介导物(Stoker, M.等(1987)Nature327:239-42 ;Nakamura, T.等(1989)Nature342:440-3 ;Bussolin o，F.等(1992) J Cell Biol 119:629-41)。已知 HGF 特异性活化Met 受体酪氨酸激酶，导致RAS和PI3-激酶信号传导途径的下游激活，并且对于诸如伤口愈合和组织再生的过程是关键性的(Grant, D.S.等(1993) Proc Natl Acad Sci USA90:1937-41 ；ffatanabe, S.等(1994)Biochem Biophys Res Communl99:1453-60 ;Derman, M.P.等(1995)Am JPhysiol268:F1211-7 ；Bevan, D.等(2004)J Patho1203:831-8 ;Nakamura, T.等(2011)JGastroenterol Hepatol 26 Suppll: 188-202)。因此，揭不 Met 受体的 HGF 依赖性活化的新机制可能提供用于刺激慢性伤口和纤维变性病症中的组织修复的新策略(Nakamura, T.等(2Oll)J Gastroenterol Hepatol 26 Suppll:188-202)?HGF是一种分泌的胞外蛋白质，其作为无活性的单链配体存在(原HGF (pro-HGF))，直至在Arg494-Val495肽键处的蛋白水解切割产生由二硫键连接的α / β异二聚体组成的双链形式，其能活化Met受体(Nakamura, T.等(1989)Nature342:440-3 ；Naldini, L-等(1992)EMBO Jl1:4825-33 ；Shimomura, T.等(1995)EurJ Biochem229:257-61 ；Lee, S.L.等(2000)J Biol Chem275:36720-5；Peek, M.等(2002)J Biol Chem277:47804-9)。HGF的域体系类似于血纤维蛋白溶酶原，其中α链包含N末端PAN域，之后是4个Kringle域重复(Κ1_4)，β链含有C末端胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶域(图1) (Donate, L.E.等(1994)Protein Sci3:2378-94 ；Tordai, H.等(1999)FEBS Lett461:63-7)。特别地，双链HGF和单链原HGF均能以高亲和力经由α链的特异性相互作用结合Met受体；然而，受体活化仅能在原HGF切割成双链形式后发生(Hartmann, G.等(1992)Proc Natl Acad Sci USA89:11574-8 ；Lokker, N.A.等(1992)EMBO Jll:2503-10 ；Naldini, L.等(1992) EMBO Jll: 4825-33)。研究表明，在肝硬化和肺纤维化的某些情况中，正常组织修复过程由于缺少可用原HGF到活性形式的蛋白水解转化而严重受损；从而导致降低的Met信号传导(Arakaki, N.等(1995)Hepatology22:1728-34 ；Kaibori, Μ.等(2002)J Surg Res106:108-14 ；Marchand-Adam, S.等(2006)Am J RespirCrit Care Medl74:58-66 ；Phin,S.等(2010)Am J Respir Cell Mol Biol42:286-93)。这不仅突显了切割步骤在调节HGF依赖性Met信号传导中的重要性，而且还表明将可用原HGF可逆转化为活性形式(能进行Met信号传导)的变构激活剂可能会得到一种刺激这些适应证中的组织修复的新治疗办法(图2)。还有许多其他的其中HGF活化具有潜在益处的适应证；对于组织和疾病的综述和部分列表，参见(Nakamura, T.等(2011) J GastroenterolHepatol 26 Suppll: 188-202)和本文中表 3。大量的结构和生物化学工作已揭示，HGF将胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活化机制用于 Met 信号传导(Kirchhofer, D.等(2004) J Biol Chem279:39915-24 ；Stamos, J.等(2004)EMBO J23:2325-35 ；Kirchhofer, D.等(2007)Proc Natl Acad SciUSA104:5306-11)。当原HGF切割后，丝氨酸蛋白酶样β链中新形成的N末端(Val495)(对应于胰凝乳蛋白酶原编号中的残基16)插入规范的‘活化袋(activation pocket) ’(图3)。详细的工作显示，N末端插入对于变构性活化β链是关键的，其允许Met结合和受体信号传导的后续活化。重要的是，研究显示将β链内的N末端Val495突变为Gly或Asp672突变为Asn阻止N末端插入，由此破坏β链对Met的结合并完全消除了双链HGF的信号传导活性(Kirchhofer, D.等(2007) Proc Natl Acad Sci USA104:5306-11)。如此，将原 HGF 转化成Met激动剂的关键机制步骤直接类似于胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的活化(Khan, A.R.等(1998)Protein Sci7:815-36 ；Hedstrom, L.(2002)Chem Revl02:4501-24)，尽管事实上丝氨酸蛋白酶样β链介导蛋白质-蛋白质相互作用而非蛋白水解活性。先前已显示，在基于细胞的Met信号传导测定法中，源自HGFP天然N末端的头7-10个残基的小肽靶向HGFP酶原样形式(scHGFii)的丝氨酸蛋白酶样活化袋，变构性激活Met结合，随后激 活原HGF的未切割形式(scHGF) (Landgraf，K.E.等(2010) J BiolChem285:40362-72)。尽管这确立了通过靶向HGF β的活化袋来变构性调节原HGF信号传导活性的能力，但该办法的治疗潜力由于激活剂肽的非常弱的结合亲和力(KD~2mM)而受到限制(Landgraf, K.E.等(2010) J Biol Chem本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的酶原激活肽(ZAP)，其中所述ZAP包含氨基酸序列X1‑X2‑X3‑X4‑Bn(SEQ ID NO:2)，其中X1是较大的疏水性氨基酸，X2是较大的疏水性氨基酸或芳香族氨基酸，X3是G、D、E、N、Q、D‑Gly、D‑Asp、D‑Glu、D‑Asn、或D‑Gln，X4是G或A，B是任意氨基酸，而n是0‑46的数字。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.10.14 US 61/547,628;2012.05.17 US 61/648,470;1.一种分离的酶原激活肽(ZAP)，其中所述ZAP包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-Bn(SEQ IDNO: 2)，其中X1是较大的疏水性氨基酸，X2是较大的疏水性氨基酸或芳香族氨基酸，X3是G、D、E、N、Q、D-Gly、D~Asp、D-Glu、D-Asn、或 D-Gln，X4 是 G 或 A，B 是任意氣基酸，而 η 是 0-46的数字。2.一种分离的酶原激活肽(ZAP)，其中所述ZAP由氨基酸序列X1-X2-X3-X4-BJSEQ IDNO:2)组成，其中X1是较大的疏水性氨基酸，X2是较大的疏水性氨基酸或芳香族氨基酸，X3是 G、D、E、N、Q、D-Gly、D-Asp、D-Glu、D-Asn、或 D-Gln, X4 是 G 或 A，B 是任意氣基酸，而 η 是0-46的数字。3.权利要求1-2中任一项的分离的ZAP，其中乂1是1匕1、￥或正亮氨酸(SEQID N0:4)。4.权利要求3的分离的ZAP，其中乂1是匕1、或V(SEQID NO:5)。5.权利要求4的分离的ZAP，其中所述X1是I(SEQ ID NO:7)。6.权利要求1-5中任一项的分离的ZAP，其中所述X2是M、L、1、V、正亮氨酸、F、或Y(SEQID NO:8)。7.权利要求6的分离的ZAP，其中X2是1、V、L或F(SEQID NO:9)。8.权利要求7的分离的ZAP，其中X2是I或V(SEQID NO: 10)。9.权利要求1-8中任一项的分离的ZAP，其中&是6、0、或N(SEQID NO: 11)。10.权利要求9的分离的ZAP，其中X3是G(SEQID NO: 12)。11.权利要求1-10中任一项的分离的ZAP，其中X4是6姊0ID NO:13)。12.权利要求1-11中任一项的分离的ZAP,其中X1-X2-X3-X4(SEQ ID NO: 14)是IVGG(SEQ ID NO:15)、 IVDG(SEQ ID NO:16),IVdG,IVGG(SEQ ID NO:17)、 IIGG(SEQ IDNO: 18)、VVNG(SEQ ID NO: 19)、VVGG(SEQ ID NO:20), IVGG(SEQ ID NO:21)、LIDG(SEQ IDNO:22)、 IVEG(SEQ ID NO:23)、 ITGG(SEQ ID NO:24)、 IVNG(SEQ ID NO:25)、 IFNG(SEQ IDNO:26)、IYGG(SEQ ID NO: 27)、ILGG(SEQ ID NO: 28)、或 IKGG(SEQ ID NO:29)、其中 d是D-天冬氨酸。13.权利要求1-12中任一项的分离的ZAP，其中所述ZAP特异性结合包含丝氨酸蛋白酶域或丝氨酸蛋白酶样域的多肽，并活化包含丝氨酸蛋白酶酶原域或丝氨酸蛋白酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：KE兰德格拉芙，RA拉扎鲁斯，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH