本发明专利技术公开了一种溶栓酶基因、由其构建的重组表达载体和重组菌以及其应用。本发明专利技术通过套叠PCR技术优化得到的qk序列可以更好地被大肠杆菌表达菌株DE3识别，同时选用增加蛋白可溶性的载体pET-40b与优化后的qk构建形成新的重组表达载体和制备表达蛋白的重组菌，可以将功能性胞外蛋白酶分泌到细胞周质中，增加融合蛋白的可溶性和活性，最终获得的表达量高和酶活性高的枯草杆菌溶栓酶。该方法不包含包涵体溶解及蛋白复性的操作，降低了成本，具有更好的实用性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种，属 于生物
技术介绍
枯草杆菌溶栓酶（Bacillus subtilis QK02)是通过检测降解纤维蛋白能力的方 法筛选到的。研宄表明，该酶具有较强的纤溶活性，是一种潜在的溶栓药物。它不仅具有良 好的溶栓效果，而且通过口服就可以达到纤溶目的，比当前临床应用的溶栓药物（如链激 酶、尿激酶等）更具备优势。专利技术人还发现在体内外及血管内皮细胞中该酶具有拮抗由血 红素 、NaNOJP H2O2带来损伤的能力。目前，该酶主要来源于野生枯草芽孢杆菌发酵的纳豆、 豆豉等，但是纳豆、豆豉的风味还不能被许多人所接受。此外，从发酵液中分离纯化纳豆激 酶通常产量较低、活性较低、生产成本高，这些因素都在一定程度上限制了纳豆激酶的开发 和利用。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有溶栓酶产量低、酶活性较低、生产成本高的缺陷，提 供一种能够高效表达枯草杆菌溶栓酶的溶栓酶基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌 以及应用。 为实现上述目的，首先，本专利技术提供一种溶栓酶基因，其核苷酸序列或核苷酸序列 的互补链如SEQ ID NO: 1所示。 本专利技术所提供的溶栓酶基因是从枯草杆菌Bacillus sutilisQK-02中提取基因 组DNA，再通过套叠 PCR扩增优化得到，其中套叠 PCR所用引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、 SEQ ID N0:9,SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: IUSEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20, SEQ ID N0:2USEQ ID N0:22,SEQ ID N0:23,SEQ ID N0:24,SEQ ID N0:25,SEQ ID N0:26, SEQ ID N0:27所示。通过套叠 PCR优化后的溶栓酶基因序列可以更好地被大肠杆菌表达菌 株BL21(DE3)识别，有助于蛋白的表达。 本专利技术还提供了上述溶栓酶基因在制备溶栓酶及相关药物中的应用。 第二，本专利技术提供了一种含有溶栓酶基因的重组载体，由pET40b表达载体和核苷 酸序列如SEQ ID NO: 1所示的溶栓酶基因经过Sal I/EcoR I酶切后重组而成。 优选地，上述重组载体的T7启动子前插入有Iac操纵子。插入Iac操纵子使该重 组载体成为一种被IPTG高效诱导的启动子 本专利技术还提供了上述含有溶栓酶基因的重组载体在制备溶栓酶及相关药物中的 应用。 第三，本专利技术提供了一种表达溶栓酶的重组菌，是将上述含有溶栓酶基因的重组 载体通过钙转的方法导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中所得到的重组菌。该重组菌用于表达 枯草杆菌溶栓酶，需要说明的是除了 CaClJi，其他如电穿孔转化法、原生质体转化法等途 径也可以将含有溶栓酶基因的重组载体导入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到的重组 菌。 本专利技术还提供了上述表达溶栓酶的重组菌在制备溶栓酶及相关药物中的应用。 第四，本专利技术所提供了一种溶栓酶的表达方法，的枯草杆菌重组蛋白的制备方法， 该方法利用上述表达溶栓酶的重组菌在蛋白表达时，其诱导过程中加入IPTG诱导，再通过 肠激酶酶切，分离纯化得到枯草杆菌溶栓酶；其中，所加入IPTG是诱导表达上述的工程菌， 再通过肠激酶酶切，分离纯化得到枯草杆的浓度为0. 1~1.0 mM，优选为0. 5mM，诱导温度为 16~37°C，优选为22°C，诱导时间为3~16小时，优选为12小时。 本专利技术还提供了上述溶栓酶的表达方法在制备溶栓酶及相关药物中的应用。 针对本专利技术的设计原理作出如下说明 研宄中，我们对现有的溶栓酶基因进行改造时，一般通过PCR扩增的方法得到枯 草杆菌溶栓酶基因组DNA，但是由于大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)对基因序列具有一定的 密码子偏爱性，因此常规方法得到的基因序列表达蛋白质的量并不高。 而套叠 PCR技术可以将序列进行优化，从而解决这个问题。套叠 PCR技术，又称 重叠区扩增基因拼接法（gene splicing by overlap extension，gene SOEing)，是利用 PCR技术在体外进行有效的基因重组和定点突变，而且不需要内切酶消化和连接酶处理。该 技术使用简易，可利用这一技术很快获得其他依靠内切酶消化方法根本难以做到的产物。 SOEing法的基本原理是向PCR产物内掺入一段新的、在原模板内不存在的序列。引物只需 与其模板有效结合而不必完全匹配，特别是5'端序列。任何与原模板不匹配的碱基都将掺 入到PCR产物中，这为创造定点突变提供了简便易行的方法。 表达载体的选择也会对蛋白表达量及蛋白活性有一定的影响。本专利技术人通过大量 实验和数据得到，pET-40b与其他载体如pET-23a相比，在蛋白表达时更具备优势，可以提 高蛋白的可溶性，进而增加目的蛋白的表达量。pET-40b是一种用于周质表达的原核质粒， 包含T7启动子、His标签、肠激酶酶切位点，具有卡那霉素抗性，可表达出DsbC(二硫键异 构酶）融合蛋白。以pET-40b作为表达载体，大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞的原核周质 表达系统具有多方面的优势：（1)在DsbC的C末端进行融合表达，DsbC作为细菌蛋白的信 号肽，引导目的蛋白穿膜到达周质空间。（2)DsbC具有还原性，能够帮助蛋白质形成正确的 二硫键，还可增加蛋白的可溶性。因此该系统表达的蛋白不需氧化复性。（3)表达出的融合 蛋白含有肠激酶酶切位点和His标签，可通过肠激酶酶切得到目的蛋白。同时His标签可 以简化融合蛋白纯化及融合蛋白酶切后目的蛋白分离的过程。（4)相对于酵母表达，该表达 系统周期较短。 本专利技术的有益效果：提供了一种溶栓酶基因、及由其构建的重组表达载体、重组菌 以及应用，本专利技术通过套叠 PCR技术优化得到的qk序列可以更好地被大肠杆菌表达菌株 DE3识别，同时选用增加蛋白可溶性的载体pET_40b与优化后的qk构建形成新的重组表达 载体和制备表达蛋白的重组菌，可以将功能性胞外蛋白酶分泌到细胞周质中，增加融合蛋 白的可溶性和活性，最终获得的表达量高和酶活性高的枯草杆菌溶栓酶。该方法不包含包 涵体溶解及蛋白复性的操作，降低了成本，具有更好的实用性。【附图说明】 图1为枯草杆菌溶栓酶的基因 qk扩增后PCR电泳结果图。 图2为枯草杆菌溶栓酶诱导型表达载体pET40b示意图。 图3为pET40b的酶切鉴定电泳结果。 图4为枯草杆菌溶栓酶在大肠杆菌中诱导表达的Western blot结果。 图5A为不同温度对枯草杆菌溶栓酶诱导分泌表达影响的电泳结果图。 图5B为不同诱导时间对枯草杆菌溶栓酶诱导分泌表达影响的电泳结果图。 图5C为IPTG浓度对枯草杆菌溶栓酶诱导分泌表达影响的电泳结果图。 图6分泌表达的枯草杆菌溶栓酶纯化后的电泳结果图。 图7为枯草杆菌溶栓酶在大肠杆菌中诱导型表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种溶栓酶基因，其核苷酸序列或核苷酸序列的互补链如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王业富，马立新，高丽，舒敏，王亚平，周康平，张展，
申请(专利权)人：武汉真福医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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