玉米CBL9基因CDS序列的应用制造技术

本发明专利技术涉及玉米CBL9基因CDS序列的应用。本发明专利技术首次提出玉米CBL9基因CDS序列的功能，将玉米CBL9基因CDS序列克隆至植物表达载体中，并将该载体转入植物体内，获得的转基因植株耐盐碱、耐渗透胁迫、耐高葡萄糖及ABA胁迫。ZmCBL9蛋白通过调控下游相关基因参与植物耐盐及渗透胁迫过程，对于培育高产的转基因农作物具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
玉米CBL9基因CDS序列的应用
本专利技术涉及转基因植物领域，具体地说，涉及玉米CBL9基因⑶S序列的应用。
技术介绍
自然界中，植物不同于动物无法逃避逆境只能应对逆境。因此，植物演化形成一套感知逆境胁迫、传导逆境信号，并在分子、细胞和生理水平上响应的精细调控机制。众多研究表明，各种胁迫环境下均会引发植物细胞中Ca2+浓度的变化。Ca2+浓度在时空上的变化代表了某种特殊的胁迫信号，称之为钙信号；这其中钙离子感受器则起了至关重要的作用，钙离子感受器可以坚持钙信号，并通过与其互作的蛋白来传导信号，调控下游基因的表达。 在植物中Ca2+-Ca2+感受器-作用蛋白-靶基因是关键的调控途径。而众多研究表明，Ca2+感受器可分为响应型感受器(sensor responders)和依赖型感受器(sensorrelays)。前者既能结合Ca2+，又具有蛋白激酶活性，一旦结合Ca2+即刻改变构象，通过调控自身分子内作用，就可实现其功能或作用。目前，在植物中研究得比较深入的响应型感受器有钙依赖型蛋白激酶(CDPK)家族。而依赖型感受器本身不具有酶活性，结合Ca2+后必须与其相互作用的蛋白激酶发生分子间作用，才能实现其功能。植物中有两类，一种是钙调素(CaM);钙调素及钙调素相关蛋白是研究最广泛的一类Ca2+结合蛋白，它含有4个能够直接结合Ca2+的典型的EF-hand结构域，其自身并没有酶活性，只有结合钙离子活化后才能进一步作用于它的目标蛋白，并实现信号的传递。钙调素作用的目标蛋白包括蛋白激酶、转运子、结构蛋白等。另一种是近年来发现为植物所特有的钙调磷酸酶B类似蛋白(CBL)。它和CaM 一样，只含有Ca2+的结合域，不含有激酶区。CBL与CaM不同的是，它调控的是一类特殊的蛋白激酶，称为 CBL 互作蛋白激酶(CBL-1nteracting protein kinases, CIPKs)。CIPK在N端含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区，并通过其特有的C末端区域(C-terminal reg1n)与CBL互作。通过对已知的基因组数据(包括EST)的扫描分析发现，CBL和CIPK只存在于植物中，说明他们可能是植物所特有的一类基因家族，可能出现于植物的早期进化中。 研究表明，在许多植物中均已找到CBLs基因家族的存在；其中，在拟南芥、水稻、玉米和杨树中发现10个CBLs，在高粱和葡萄中分别发现6个和8个CBLs基因。近年来对CBL基因家族的研究主要集中在模式植物拟南芥中，并且已报道的CBL基因大多参与了拟南芥对逆境胁迫的响应。AtCBL4/S0S3是最早报道的在拟南芥应对盐胁迫时起重要功能的基因，该基因主要在根中表达并与AtCIPK24/S0S2互作，后者可以磷酸化NHX7/S0S1将Na+运出细胞，减少体内Na+含量；AtCBL10/SCaBP8主要在茎和叶片中表达，参与了对Na+区隔化，降低高盐对植物的损害；AtCBLl和AtCBL9通过参与不同的信号通路，对植株响应逆境尤其是在对K+和N03_的吸收过程中起着重要的作用。AtCBL2和AtCBL3可被光照诱导，并在维持细胞内离子平衡中起着重要的作用。此外，AtCBL5在应对高盐及渗透胁迫中也起着重要的作用。而AtCBL6、AtCBL7和AtCBL8的功能则未有报道。对于玉米CBLs基因的研究仅发现ZmCBL4在应对高盐胁迫中起着重要的作用。 因此，目前对于植物CBL基因的研究方兴未艾，仅有的一些研究结果只是对该领域的初步探索，这方面的研究工作基本上是在模式植物拟南芥上进行的。对于重要作物(如水稻、玉米、小麦等)的此类基因的研究还鲜有报道，特别是有关玉米CBL基因的功能研究尚未见应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供玉米CBL9基因CDS序列的应用。 为了实现本专利技术目的，本专利技术提供玉米CBL9基因⑶S序列在提高植物耐盐碱、耐渗透胁迫、耐高葡萄糖及ABA胁迫的能力中的应用。 优选地，所述植物为拟南芥等。 本专利技术中涉及的玉米钙调磷酸酶B类似蛋白9 (ZmCBL9)的氨基酸序列如Seq IDN0.2所示。ZmCBL9基因CDS序列为: i)Seq ID N0.1所示的核苷酸序列；或 ii)Seq ID N0.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或 iii)在严格条件下与Seq ID N0.1所示序列杂交的核苷酸序列； 所述严格条件为在含0.1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1% SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下杂交，并用该溶液洗膜。 本专利技术还提供含有ZmCBL9基因⑶S序列的载体，出发载体优选为植物双元表达载体 ρ3301ο 本专利技术还提供含有上述的载体的工程菌、转基因细胞系。 本专利技术还提供一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将上述含有ZmCBL9基因CDS序列的载体转入植物体内，筛选转基因植株。 本专利技术还提供一种能够高效表达ZmCBL9的转基因植株，该植株表现为对盐胁迫的抗性。 所述转基因植株的构建方法如下: 1、依据目的基因的序列，设计引物，从玉米cDNA扩增ZmCBL9基因⑶S序列，与pGEM-Τ载体连接，经过测序确定所获得的序列与目的片段一致，所得载体命名为pGEM-ZmCBL9。 2、将pGEM_ZmCBL9载体及植物表达载体p3301，分别用Nco I和BstE II进行酶切，然后使用T4DNA连接酶，将ZmCBL9片段与p3301的载体片段连接，然后转化DH5 α感受态细胞，获得重组克隆，经过PCR检测后，将单克隆送测序，测序正确的克隆进行扩繁，提质粒,命名为 p3301-ZmCBL9。 3、用 p3301-ZmCBL9 转化农杆菌 GV3101 菌株。 4、转化拟南芥，获得纯合的转化阳性苗株系。 5、将转基因株系分别在MS、0.7μΜ ΑΒΑ、4%葡萄糖、150mM NaCl和325mM甘露醇的MS固体培养基上培养，获得耐盐、耐渗透、耐葡萄糖和ABA的转基因材料。 本专利技术进一步提供用于扩增玉米CBL9基因⑶S序列的引物对，包括正向引物F5’ -ATGGGGTGCTTCCAT-3’ 和反向引物 R5’ -TCACGTGACGAGATC-3’。 本专利技术首次提出玉米CBL9基因⑶S序列的功能，将玉米CBL9基因⑶S序列克隆至植物表达载体中，并将该载体转入植物体内，获得的转基因植株耐盐碱、耐渗透胁迫、耐高葡萄糖及ABA胁迫。ZmCBL9蛋白通过调控下游相关基因参与植物耐盐及渗透胁迫过程，对于培育高产的转基因农作物具有重要意义。 【附图说明】 图1为本专利技术中涉及的植物双元表达载体p3301的质粒图谱。 图2为本专利技术实施例3中ZmCBL9转基因株系目的基因的PCR检测结果其中，M:Marker ；1:正对照(以ZmCBL9超表达载体为PCR模板)；2_11:ZmCBL9不同转基因株系目的基因扩增结果；WT:负对照(以野生型拟南芥Col的DNA为PCR模板)。 图3为本专利技术实施例4中转基因拟南芥与野生型植株在含有不同胁迫条件的培养基上生长情况比较；其中，转35S::ZmCBL9基因拟南芥种子本文档来自技高网...

【技术保护点】
玉米CBL9基因CDS序列在提高植物耐盐碱、耐渗透胁迫、耐高葡萄糖及ABA胁迫的能力中的应用；其中，所述玉米CBL9基因CDS序列为：i)Seq ID No.1所示的核苷酸序列；或ii)Seq ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与Seq ID No.1所示序列杂交的核苷酸序列；所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

【技术特征摘要】
1.玉米CBL9基因⑶S序列在提高植物耐盐碱、耐渗透胁迫、耐高葡萄糖及ABA胁迫的能力中的应用； 其中，所述玉米CBL9基因⑶S序列为: i)SeqID N0.1所示的核苷酸序列；或 ii)SeqID N0.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或 iii)在严格条件下与SeqID N0.1所示序列杂交的核苷酸序列； 所述严格条件为在含0.1% SDS的0.1 X SSPE或含0.1% SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下杂交，并用该溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑军，张凡，牟颖熙，王国英，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11