【技术实现步骤摘要】
用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡及制备方法
本专利技术属于药品检测领域，具体涉及一种基于荧光微球标记的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡及制备方法。
技术介绍
芬太尼，适用于各种疼痛及外科、妇科等手术后和手术过程中的镇痛；也用于防止或减轻手术后出现的谵妄；还可与麻醉药合用，作为麻醉辅助用药；与氟哌利多配伍制成“安定镇痛剂”，用于大面积换药及进行小手术的镇痛。2019年4月1日，公安部、国家卫生健康委、国家药监局联合发布公告，宣布从2019年5月1日起将芬太尼类物质列入《非药用类麻醉药品和精神药品管制品种增补目录》。本专利技术检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，检测成本低，同时具有检测特异性强，批内和批间差异小、灵敏度高和操作简单快速，适合大批量样品的检测，然而该法不需要专业人员进行操作。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的之一是提供一种基于荧光微球标记的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡。本专利技术的目的之二是提供上述用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡的制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术的一种用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡，它包括：卡壳、A检测试纸条和B检测试纸条，A检测试纸条和B检测试纸条均包括：PVC背衬、样品垫、结合垫、检测线、质控线、反应垫和吸收垫，反应垫固定在PVC背衬上，结合垫的一端搭接在反应垫的一端上，另一端固定在PVC背衬...
【技术保护点】
1.一种用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡，它包括：卡壳(8)、A检测试纸条和B检测试纸条，A检测试纸条和B检测试纸条均包括：PVC背衬(7)、样品垫(1)、结合垫(2)、检测线(3)、质控线(5)、反应垫(4)和吸收垫(6)，反应垫(4)固定在PVC背衬(7)上，结合垫(2)的一端搭接在反应垫(4)的一端上，另一端固定在PVC背衬(7)上，样品垫(1)的一端搭接在结合垫(2)的另一端上，另一端固定在PVC背衬(7)上，吸收垫(6)的一端搭接在反应垫(4)的另一端上，另一端固定在PVC背衬(7)上，检测线(3)和质控线(5)依次设置于反应垫(4)上，其中检测线(3)靠近结合垫(2)的一端，质控线(5)靠近吸收垫(6)的一端，所述的检测线(3)与质控线(5)彼此平行，并且平行于结合垫(2)的搭接端和吸收垫(6)的搭接端，它们之间的距离为5～8mm，其特征在于：所述A检测试纸条的结合垫(2)为涂覆有荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体A的玻璃纤维膜，它的检测线(3)为包被有芬太尼类物质人工抗原A，它的质控线(5)为包被有羊抗兔抗体；B检测试纸条的结合垫(2)为涂覆有荧光微球标记的抗...
【技术特征摘要】
1.一种用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡，它包括：卡壳(8)、A检测试纸条和B检测试纸条，A检测试纸条和B检测试纸条均包括：PVC背衬(7)、样品垫(1)、结合垫(2)、检测线(3)、质控线(5)、反应垫(4)和吸收垫(6)，反应垫(4)固定在PVC背衬(7)上，结合垫(2)的一端搭接在反应垫(4)的一端上，另一端固定在PVC背衬(7)上，样品垫(1)的一端搭接在结合垫(2)的另一端上，另一端固定在PVC背衬(7)上，吸收垫(6)的一端搭接在反应垫(4)的另一端上，另一端固定在PVC背衬(7)上，检测线(3)和质控线(5)依次设置于反应垫(4)上，其中检测线(3)靠近结合垫(2)的一端，质控线(5)靠近吸收垫(6)的一端，所述的检测线(3)与质控线(5)彼此平行，并且平行于结合垫(2)的搭接端和吸收垫(6)的搭接端，它们之间的距离为5～8mm，其特征在于：所述A检测试纸条的结合垫(2)为涂覆有荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体A的玻璃纤维膜，它的检测线(3)为包被有芬太尼类物质人工抗原A，它的质控线(5)为包被有羊抗兔抗体；B检测试纸条的结合垫(2)为涂覆有荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体B的玻璃纤维膜，它的检测线(3)为包被有芬太尼类物质人工抗原B，它的质控线(5)为包被有羊抗兔抗体。
2.根据权利要求1所述的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡，其特征在于：所述的芬太尼类物质人工抗原A为含有N-(2-苯乙基)-4-哌啶酮(CAS号：39742-60-4)结构的物质-载体蛋白偶联物；芬太尼类物质人工抗原B为含有N-[4-(methoxymethyl)piperidin-4-yl]-N-phenylpropionamide(CAS号：61086-18-8)结构的物质-载体蛋白偶联物。
3.根据权利要求2所述的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡，其特征在于：所述的芬太尼类物质人工抗原A和芬太尼类物质人工抗原B中的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、铁蛋白或多聚赖氨酸中的一种；所述羊抗兔抗体为能捕获荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体的羊抗兔IgG；荧光微球为水溶性荧光微球，所述水溶性荧光微球的发射波长为450nm～650nm，粒径为100～300nm。
4.根据权利要求3所述的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡，其特征在于：所述A检测试纸条的结合垫(2)和B检测试纸条的结合垫(2)中的抗芬太尼类物质特异性抗体A和抗芬太尼类物质特异性抗体B的特异性和灵敏度不同；所述样本垫(1)为玻璃纤维膜；吸收垫(6)为吸水纸；反应垫(4)为硝酸纤维素膜。
5.如权利要求4所述的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(a)将N-(2-苯乙基)-4-哌啶酮(CAS号：39742-60-4)经过肟化与还原反应后，与载体蛋白偶联，制备得到芬太尼类物质人工抗原A；
将N-[4-(methoxymethyl)piperidin-4-yl]-N-phenylpropionamide(CAS号：61086-18-8)经过取代与还原反应后，与载体蛋白偶联，制备得到芬太尼类物质人工抗原B；
(b)用荧光微球分别标记抗芬太尼类物质抗体A和抗芬太尼类物质抗体B，得到荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体A和荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体B；
(c)用步骤(b)制备得到的荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体A和荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体B分别包被在结合垫(2)上，得到A检测试纸条的结合垫(2)和B检测试纸条的结合垫(2)；
(d)在两个反应垫(2)上分别设置一条检测线(3)和一条质控线(5)，用步骤(a)制备得到的芬太尼类物质人工抗原A包被上述其中一个反应垫(2)的检测线(3)，用羊抗兔抗体包被上述反应垫(2)的质控线(5)，制备得到A检测试纸条的反应垫(4)；用步骤(a)制备得到的芬太尼类物质人工抗原B包被上述其中另一个反应垫(2)的检测线(3)，用羊抗兔抗体包被上述反应垫(2)的质控线(5)，制备得到B检测试纸条的反应垫(4)；
(e)在PVC背衬(7)上粘附A检测试纸条的反应垫(4)，在上述反应垫(4)的两端分别搭接有A检测试纸条的结合垫(2)的一端和吸收垫(6)的一端，在上述结合垫(2)的另一端搭接有样品垫(1)，即得A检测试纸，将上述A检测试纸沿着其纵向进行切割成，使得切割下来的每条试纸条均包括：PVC背衬(7)、样品垫(1)、结合垫(2)、检测线(3)、质控线(5)、反应垫(4)和吸收垫(6)，最终得到A检测试纸条；
在PVC背衬(7)上粘附B检测试纸条的反应垫(4)，在上述反应垫(4)的两端分别搭接有B检测试纸条的结合垫(2)的一端和吸收垫(6)的一端，在上述结合垫(2)的另一端搭接有样品垫(1)，即得B检测试纸，将上述B检测试纸沿着其纵向进行切割成，使得切割下来的每条试纸条均包括：PVC背衬(7)、样品垫(1)、结合垫(2)、检测线(3)、质控线(5)、反应垫(4)和吸收垫(6)，最终得到B检测试纸条；
(f)将步骤(e)得到的A检测试纸条和B检测试纸条固定在卡壳(8)上，得到用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(a)所述的芬太尼类物质人工抗原A的具体制备方法为：取20mg羧甲基羟胺半盐酸盐(简称：CMO)用1mL吡啶充分溶解得到a液；取5mg的N-(2-苯乙基)-4-哌啶酮(CAS号：39742-60-4)用1mL甲醇溶解得到b液；取150mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称：EDC)和43.2mg的N-羟基琥珀酰亚胺(简称：NHS)用2mL的去离子水溶解得到c液；取30mg的载体蛋白用2mL的0.05MpH7.4磷酸盐缓冲溶液溶解得到d液；
先将上述a液与b液以1:1的比例混合，并在70℃水浴下反应6～8小时，反应完成后用氮气吹干，再加入1mL的去离子水和0.2mL的0.1M的HCl溶液震荡3min后，加入3mL的乙酸乙酯萃取5min，再静置2min后取上层液体进行氮气吹干，吹干后用1mL的N,N-二甲基甲酰胺(简称：DMF)溶解，再将上述溶液中缓慢地滴加2mL的c液，边滴加边搅拌，于室温条件下反应16小时，最后在搅拌下逐渐加入2mL的d液，于室温条件下反应4小时后，再缓慢加入0.5mL的8mg/ml的硼氢化钠溶液，于室温条件下反应2小时，反应完成后，用1000ml的0.05M、pH7.4磷酸盐缓冲溶液于4℃透析3天，其中每隔6-8小时换液一次，透析完成后，即得芬太尼类物质人工抗原A；
步骤(a)所述的芬太尼类物质人工抗原B的具体制备方法为：取3mg的4-氯丁酸(CAS号：627-00-9)用1mL的N,N-二甲基甲酰胺(简称：DMF)充分溶解得到e液；取6.5mg的N-[4-(methoxymethyl)piperidin-4-yl]-N-phenylpropionamide(CAS号：61086-18-8)用1mL的N,N-二甲基甲酰胺(简称：DMF)溶解得到f液；取150mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称：EDC)和43.2mg的N-羟基琥珀酰亚胺(简称：NHS)用2mL的去离子水溶解得到g液；取30mg的载体蛋白用2mL0.05M、pH7.4的磷酸盐缓冲溶液溶解得到h液；
先将上述e液与f液以1:1的比例混合，并在60℃水浴下反应6～8小时，反应完后氮气吹干，再加入2mL的去离子水震荡混匀3min后，加入5mL乙酸乙酯震荡萃取5min，再静置2min后取上层液体进行氮气吹干，吹干后用1mL的N,N-二甲基甲酰胺(简称DMF)溶解，再将上述溶液中缓慢地滴加2mL的g液，边滴加边搅拌，于室温条件下反应16小时，最后在搅拌下逐渐加入2mL的h液，于室温条件下反应4小时后，再缓慢加入0.5mL的8mg/ml的硼氢化钠溶液，于室温条件下反应2小时，反应完成后，用1000ml的0.05M、pH7.4磷酸盐缓冲溶液于4℃透析3天，其中每隔6-8小时换液一次，透析完成后即得芬太尼类物质人工抗原B；上述步骤(d)所述的A检测试纸条和B检测试纸条的人工抗原包被检测线(3)的包被浓度为0.5～1μg/cm2，羊抗兔抗体包被质控线(5)的包被浓度为0.5～1μg/cm2；步骤(b)中所述的荧光微球的浓度为1～2μg/ml；上述步骤(e)中，所述的A检测试纸条和B检测试纸条的宽度为2.5～3.5mm。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述抗芬太尼类物质特异性抗体A的制备方法包括：
(一)带有抗芬太尼类物质特异性抗体A血液的制备
(1)挑选一只6周大小的健康新西兰大白兔，每只约2Kg，使其适应新的生活环境，即继续饲养一周；
(2)用pH为7.0的0.01mol/LPBS缓冲液将上述芬太尼类物质人工抗原A的浓度调整至1mg/mL；取人工抗原A与等体积的弗氏完全佐剂进行混匀，乳化成油包水状态，得到注射芬太尼类物质人工抗原A，取1mg注射芬太尼类物质人工抗原A对上述新西兰大白兔的多点颈背部皮下和多点腿部肌肉进行第一次注射免疫；
(3)在第一次注射免疫完成后，每隔3～4周，取0.4mg注射芬太尼类物质人工抗原A，对上述新西兰大白兔的多点颈背部皮下和多点腿部肌肉进行一次注射免疫，一共累计注射免疫4-5次；
(4)在最后一次注射免疫后的3周后，从上述新西兰大白兔的心脏中取5ml血液；
(二)芬太尼类物质人工抗原A免疫亲和柱的制备
(5)配制以下溶液
(5.1)配制碳酸氢钠溶液
量取42.005g的pH＝8.3、浓度为0.1M的NaHCO3溶液，加入超纯水5000mL后，用HCl调节pH至8.3后定容至5000mL，得到碳酸氢钠溶液；
(5.2)配制盐酸溶液
量取83.33μL、浓度为1mM的浓盐酸滴入超纯水中，最终定容至1000mL；
(5.3)、配制Tris-HCl缓冲液
量取12.114g的pH＝8.0、浓度为0.1M的Tris溶液，加入超纯水900mL后，用浓HCl调节pH至8.0后定容至1000mL；
(5.4)配制醋酸缓冲液
量取5.095g的pH＝4.0、浓度为0.1M冰醋酸溶液，然后加入醋酸钠2.062g和5.844gNaCl，最后用超纯水定容至1000mL；
(6)用琼脂糖凝胶偶联芬太尼类物质人工抗原A
(6.1)秤取1g琼脂糖凝胶，将之悬浮于步骤(5.2)配制的盐酸溶液中，在20-30min后，1g琼脂糖凝胶溶胀成3.5mL的柱料，，在溶胀后的15min内，用200mL的上述盐...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹明强，王新华，叶剑锋，汪兵，王升，赵屹，
申请(专利权)人：中检国研北京科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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