替换WLS表位的重组蛋白及其编码核苷酸和应用制造技术

本发明专利技术属于医药生物领域，具体涉及GPC3-HBsAg重组蛋白及其肿瘤疫苗中的应用。所述重组蛋白为重组的乙肝表面抗原(HBsAg)，具体是HBsAg内源性CTL表位被其他外源CTL表位替换的重组蛋白；所述其他外源CTL表位为GPC3的CTL表位。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药生物领域，具体涉及GPC3-HBsAg重组蛋白及其编码核苷酸。
技术介绍
磷脂酰肌醇蛋白聚糖（glypican)家族是存在于细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白 多糖的新家族。迄今已报告有五种磷脂酰肌醇蛋白聚糖（磷脂酰肌醇蛋白聚糖1，磷脂酰 肌醇蛋白聚糖2,磷脂酰肌醇蛋白聚糖3,磷脂酰肌醇蛋白聚糖4,和磷脂酰肌醇蛋白聚糖5) 是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成员。该家族的成员有大小均一（约60kDa)的核心蛋白，共 有特异、高度保守的半胱氨酸序列，并通过糖基磷脂酰肌醇（GPI)锚定结合到细胞膜上。 Motomura等人发现GPC3在小鼠体内可诱导出GPC3特异性的抗肿瘤免疫，但GPC3 不会在小鼠体内导致自身免疫疾病的发生。同时发现，具有GPC3特异性的杀伤性T细胞 (CTL)可以向表达GPC3的肿瘤组织发生定向迀移，而不引起自身免疫性的破坏。因此，GPC3 诱导的特异性CTL定向移动发挥抗肿瘤免疫作用可以作为治疗HCC及黑色瘤的一种可能手 段。并通过实验证实CTL表位可在小鼠体内被CTL所识别并诱导特异性的细胞免疫，该发 现对以GPC3为靶点的肿瘤免疫治疗有重要的意义。HBsAg疫苗与传统的疫苗相比具有如下优点：1.无需免疫佐剂，即能诱导出高效 而特异的细胞免疫和体液免疫；2.HBsAg本身不能复制，也无感染性；3.HBsAg在体外能被 大量扩增，并易于浓缩和纯化。上述特点表明，HBsAg具有减毒活病毒疫苗的免疫原性，但 无其缺点。以特异性的外源抗原（基因）插入HBsAg或以外源CTL表位替代HBsAg上特 异性的内源CTL表位能否在体内诱导出高效而特异的细胞免疫，越来越成为疫苗研究的热 点。现已证明，在保留其有效的包装蛋白表位基础上，在HBsAg基因开放性阅读框架（open readingframe，0RF)上定位突变掉内源性CTL表位并建立核酸内切酶酶切位点，构建好 的重组质粒允许插入一个或多个外源表位，在保留HBsAg部分生物学和免疫学特性的基础 上，还能保证外源性表位具有免疫活性。 非专利文献王文敬等，GPC-3CTL表位表达载体构建，南方医科大学学报，2009， 29 (8)，1548-1550 ;公开了 一种构建编码GPC3-HBsAg重组蛋白表达载体，其采用GPC3的 CTL表位分别替换HBsAg中的FLG、LLD和SIL表位而获得表达载体，并具有一定免疫原性。 但是，本领域中HBsAg存在多个CTL表位，替换的表位不同，免疫原性相差较大，因此选择合 适的HBsAg的CTL表位用于替换，对获得的重组蛋白的免疫原性具有决定性的影响。
技术实现思路
本专利技术的第一方面是提供一种GPC3_HBsAg重组蛋白，其以重组的乙肝表面抗原 (HBsAg)为分子骨架，利用外源CTL表位替换HBsAg内源性CTL表位；所述其他外源CTL表 位为GPC3的CTL表位。 在本专利技术的一个优选实施方案中，在所述重组的乙肝表面抗原（HBsAg)中，一个、 二个、三个或更多个HBsAg内源性CTL表位被一个、二个、三个或更多个GPC3的CTL表位所 替换。 在本专利技术的另一个实施方案中，所述重组的乙肝表面抗原（HBsAg)的氨基酸序列 如SEQIDN0:1所示；在所述SEQIDN0:1序列中，HBsAg内源性CTL表位相应地被GPC3CTL 表位所替换。 在本专利技术的另一个实施方案中，所述编码fffisAg内源性CTL表位选自下表中的一 个、二个、三个或更多个表位，具体如表1所示： 表1HBsAg蛋白中内源性CTL表位 在本专利技术的一个优选的实施方案中，所述HBsAg内源性CTL表位选自包含WLS表 位的一个或更多个表位，进一步地所述HBsAg内源性CTL表位选自WLS以及FLL、LLC、FLG、 LLV、SIL和/或LLP表位中的一个、二个、三个或更多个表位。 所述GPC3CTL表位选自下表中一个、二个、三个或更多个表位，具体如表2所不： 表 2GPC3CTL表位 在本专利技术的又一个优选的实施方案中，所述GPC3CTL表位选自FVGEFFTDV、 HLGSDINV、FLAELAYDL和 / 或RMLTRMWYC中一个或多个表位。 在本专利技术的又一个优选的实施方案中，所述重组蛋白序列如SEQIDN0 :2所示，其 为采用GPC3CTL表位FVGEFFTDV替换HBsAg内源性CLT表位FLG、WLS和SIL得到的重组蛋 白。 在本专利技术的又一个优选的实施方案中，所述重组蛋白序列如SEQIDN0 :3所示，其 为采用GPC3CTL表位FVGEFFTDV替换HBsAg内源性CLT表位FLG和WLS得到的重组蛋白。 在本专利技术的又一个优选的实施方案中，所述重组蛋白序列如SEQIDN0 :4所示，其 为采用GPC3CTL表位FVGEFFTDV替换HBsAg内源性CLT表位WLS和SIL得到的重组蛋白。 在本专利技术的又一个优选的实施方案中，所述重组蛋白序列如SEQIDN0 :5所示，其 为采用GPC3CTL表位FVGEFFTDV替换HBsAg内源性CLT表位WLS得到的重组蛋白。 本专利技术的第二方面是提供编码上述重组蛋白的核苷酸序列。在本领域中，根据上 述重组蛋白的氨基酸序列而获得编码核苷酸序列是本领域技术人员已知的，例如，根据密 码子规则获得编码上述重组蛋白的RNA或DNA序列，例如，编码SEQIDN0 :1氨基酸序列的 核苷酸序列如SEQIDN0 :6所示。 本专利技术的第三方面是所述重组蛋白在制备肿瘤疫苗中的应用。 本专利技术的第四方面是所述重组蛋白在制备治疗/预防肿瘤药物中的应用。 本专利技术中所述肿瘤的种类没有特别限定，优选为表达GPC3的肿瘤，具体选自，包 括但不限于食道癌、乳癌、甲状腺癌、直肠癌、胰腺癌、恶性黑色素瘤（黑素瘤）、恶性淋巴 瘤、骨肉瘤、成嗜铬细胞瘤、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、脑瘤、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性 白血病、肾癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌或肉瘤等。【具体实施方式】 下面将举例说明本专利技术。需要指出的是，以下说明仅仅是对本专利技术要求保护的技 术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本专利技术的保护范围以所附权利要求 书记载的内容为准。 下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆实 验指南（SambrookJ，etal. 2008.MolecularCloning:ALaboratoryManual，3rdEd.)中 所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件来进行。 实施例1重组HBsAg载体质粒的构建 根据基因工程技术，采用PCR定位突变技术对HBsAg基因进行改造，从而获得一段 改良的HBsAg基因片段，其序列如SEQIDN0 :6所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQID NO:1所示。然后，将上述HBsAg基因片段插入pcDNA3. 1+质粒中，从而获得重组HBsAg载 体质粒。 上述HBsAg基因片段也可以通过合成获得，并通过PCR技术进行大量扩增。 实施例2编码重组蛋白的DNA分子及表达载体的构建 (l)SOEingPCR扩增 按照非专利文献王文敬等，GPC-3CTL表位表达载体构建，南方医科大学学报， 2009, 29 (本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种GPC3‑HBsAg重组蛋白，其以重组的乙肝表面抗原(HBsAg)为分子骨架，利用外源CTL表位替换HBsAg内源性CTL表位；所述其他外源CTL表位为GPC3的CTL表位。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李明松，
申请(专利权)人：李明松，南方医科大学南方医院，广州白云山拜迪生物医药有限公司，东莞市长大生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44