本发明专利技术公开了一种血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法，是在包被抗sH2a单克隆抗体的固相材料中，加入sH2a标准品或待测血清样品，孵育，洗涤，再加入镧系元素离子标记的能够与前述抗sH2a单克隆抗体配对的抗sH2a单克隆抗体，孵育，洗涤，再加入解离增强液，震荡，测定荧光强度，根据sH2a标准品测定结果绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测血清样品中的sH2a含量；本发明专利技术同时公开了一种血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法检测试剂盒；本发明专利技术检测方法和试剂盒具有线性范围宽、零本底、稳定性好、灵敏度高、特异性强、准确度高、检测时间短等优点，可用于肝病患者血清sH2a含量检测，便于临床肝病的辅助诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白检测
，涉及一种蛋白定量检测方法及检测试剂盒。
技术介绍
sH2a是一种在肝脏特异性表达的可溶性分泌型蛋白，分子量约35KD。它与另一种 也只在肝细胞表达的去唾液酸受体蛋白（ASGPR)的H2亚基同源，但研究表明，sH2a并不参 与ASGRP H2亚基的组装。sH2a的前体蛋白在肝细胞表达出来后，在内质网被剪切去除约5 个氨基酸变成sH2a，即被释放到细胞外，进入血液循环。正常人外周血中sH2a保持较高水 平，但在肝损伤、肝炎、肝纤维化等肝病患者中sH2a的含量显著下降，因此，通过检测患者 血中sH2a含量可获得肝脏功能状况的信息，便于临床肝损伤、肝炎、肝纤维化等肝病的辅 助诊断。 专利技术人在前期研究工作中专利技术了一种sH2a定量检测试剂盒（CN103336125A)，系 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法来定量检测sH2a，但该专利技术仍然存在线性范围较窄，检测 本底较高，检测耗时较长等问题，还有待进一步改进。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析 法及其检测试剂盒，具有线性范围宽、零本底、稳定性好、灵敏度高、特异性强、准确度高、检 测时间短等优点。 经研究，本专利技术提供如下技术方案： 1.血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法，包括以下步骤： A.固相抗体的制备 将抗sH2a单克隆抗体稀释后作为包被液包被固相材料，洗涤去除包被液，再用含 有封闭蛋白的缓冲液作为封闭液封闭固相材料，洗涤去除封闭液，干燥，制得包被抗sH2a 单克隆抗体的固相材料； B.标记抗体的制备 选择能够与步骤A中所述抗sH2a单克隆抗体配对的抗sH2a单克隆抗体，进行镧 系元素离子标记，制得标记抗体； C.检测 在步骤A制得的包被抗sH2a单克隆抗体的固相材料中，加入sH2a标准品或待测 血清样品，孵育，洗涤固相材料，再加入步骤B制得的标记抗体，孵育，洗涤固相材料，再加 入解离增强液，震荡，测定荧光强度，根据sH2a标准品测定结果绘制标准曲线，根据标准曲 线计算待测血清样品中的sH2a含量。 进一步，所述血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法包括以下步骤： A.固相抗体的制备 将抗sH2a单克隆抗体用浓度为50mM、pH为9. 6的碳酸盐缓冲液稀释后作为包被 液包被微孔反应板，洗涤去除包被液，再用含有牛血清白蛋白的PBST作为封闭液封闭微孔 反应板，洗涤去除封闭液，干燥，制得包被抗sH2a单克隆抗体的微孔反应板； B.标记抗体的制备 选择能够与步骤A中所述抗sH2a单克隆抗体配对的抗sH2a单克隆抗体，进行三 价铕离子标记，制得标记抗体； C.检测 将sH2a标准品用PBS稀释至不同浓度，作为梯度sH2a标准溶液；将步骤B制得的 标记抗体用反应缓冲液稀释，制得标记抗体工作液；在步骤A制得的包被抗sH2a单克隆抗 体的微孔反应板中，加入上述梯度sH2a标准溶液或待测血清样品，孵育，洗涤微孔反应板， 再加入标记抗体工作液，孵育，洗涤微孔反应板，再加入解离增强液，震荡，用时间分辨免疫 荧光分析仪于激发波长340nm、发射波长614nm测定荧光强度，根据梯度sH2a标准溶液测定 结果绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测血清样品中的sH2a含量。 更进一步，所述血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法包括以下步骤： A.固相抗体的制备 将抗sH2a单克隆抗体用浓度为0. 05mol/L、pH为9. 6的碳酸盐缓冲液稀释至 5 μ g/ml作为包被液，以100 μ 1/孔包被微孔反应板,4°C包被过夜,洗漆去除包被液,再用 含有质量百分含量为1%的牛血清白蛋白的PBST作为封闭液，以100 μ 1/孔封闭微孔反应 板，37°C封闭2小时，洗涤去除封闭液，37°C干燥，制得包被抗sH2a单克隆抗体的微孔反应 板； B.标记抗体的制备 选择能够与步骤A中所述抗sH2a单克隆抗体配对的抗sH2a单克隆抗体，进行三 价铕离子标记，制得标记抗体； C.检测 将sH2a标准品用PBS分别稀释至0· l、l、10、100、1000、10000ng/ml，作为梯度 sH2a标准溶液；将步骤B制得的标记抗体用反应缓冲液按体积比为1:5000进行稀释，制得 标记抗体工作液；在步骤A制得的包被抗sH2a单克隆抗体的微孔反应板中，加入上述梯度 sH2a标准溶液或待测血清样品，100 μ 1/孔，37°C孵育1小时，洗涤微孔反应板，再加入标 记抗体工作液，100 μ 1/孔，37°C孵育1小时，洗涤微孔反应板，再加入解离增强液，100 μ 1/ 孔，震荡20分钟，用时间分辨免疫荧光分析仪于激发波长340nm、发射波长614nm测定荧光 强度，根据梯度sH2a标准溶液测定结果绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测血清样品中 的sH2a含量。 进一步，步骤B中所述标记抗体为含有三价铕离子标记抗sH2a单克隆抗体与牛 血清白蛋白的Tris-HCl缓冲液；步骤C中所述sH2a标准品为含有sH2a、牛血清白蛋白与 防腐剂的Tris-HCl缓冲液；步骤C中所述反应缓冲液为含有牛血清白蛋白、乙二胺四乙 酸、T Ween40、惰性染料与防腐剂的Tris-HCl缓冲液；步骤C中所述解离增强液为由曲拉通 X-100、冰乙酸和螯合剂组成的水溶液；步骤A和C中所述洗涤均以含有TWeen20与防腐剂 的Tris-HCl缓冲液作为洗涤液。 更进一步，步骤B中所述标记抗体为含有三价铕离子标记抗sH2a单克隆抗体与牛 血清白蛋白的Tris-HCl缓冲液，其中三价铕离子标记抗sH2a单克隆抗体的浓度为0. 1 μ g/ ml，牛血清白蛋白的质量百分浓度为0. 5%，Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM、pH为7. 8 ;步 骤C中所述sH2a标准品为含有sH2a、牛血清白蛋白与防腐剂的Tris-HCl缓冲液，其中牛 血清白蛋白的质量百分浓度为〇. 5%，防腐剂的质量百分浓度为0. 05%，Tris-HCl缓冲液的 浓度为50mM、pH为7.8 ;步骤C中所述反应缓冲液为含有牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、 TWeen40、惰性染料苋菜红与防腐剂的Tris-HCl缓冲液，其中牛血清白蛋白的质量百分浓 度为0. 5%，乙二胺四乙酸和TweeMO的质量百分浓度分别为0. 01%，惰性染料的质量百分浓 度为0. 02%，防腐剂的质量百分浓度为0. 05%，Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM、pH为7. 8 ; 步骤C中所述解离增强液为由曲拉通X-100、冰乙酸和螯合剂氨三乙酸组成的水溶液，其中 曲拉通X-100的质量百分浓度为0. 1%，冰乙酸的质量百分浓度为0. 01%，螯合剂的浓度为 15 μ M ;步骤A和C中所述洗涤均以含有TWeen20与防腐剂的Tris-HCl缓冲液作为洗涤液， 其中T Ween20的质量百分浓度为0. 01%，防腐剂的质量百分浓度为0. 05%，Tris-HCl缓冲液 的浓度为50mM、pH为7. 8。 2.血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法检测试剂盒，包含以下组分：包被抗 sH2a单克隆抗体的固相材料，镧系元素离子标记的抗sH2a单克隆抗体，以及sH2a标准品； 所述固相材料上包被的抗s本文档来自技高网...
【技术保护点】
血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法，其特征在于，包括以下步骤：A．固相抗体的制备将抗sH2a单克隆抗体稀释后作为包被液包被固相材料，洗涤去除包被液，再用含有封闭蛋白的缓冲液作为封闭液封闭固相材料，洗涤去除封闭液，干燥，制得包被抗sH2a单克隆抗体的固相材料；B．标记抗体的制备选择能够与步骤A中所述抗sH2a单克隆抗体配对的抗sH2a单克隆抗体，进行镧系元素离子标记，制得标记抗体；C．检测在步骤A制得的包被抗sH2a单克隆抗体的固相材料中，加入sH2a标准品或待测血清样品，孵育，洗涤固相材料，再加入步骤B制得的标记抗体，孵育，洗涤固相材料，再加入解离增强液，震荡，测定荧光强度，根据sH2a标准品测定结果绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测血清样品中的sH2a含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王弢，秦勇，周小进，陈菲，
申请(专利权)人：苏州工业园区为真生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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