本发明专利技术涉及能够诱导α干扰素表达的HBV-CpG寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1或2所示，还涉及用纳米材料PEG-PLA包被所述的HBV-CpG寡核苷酸序列制得的纳米颗粒，以及所述纳米颗粒在乙型肝炎预防和治疗中的应用，其中纳米材料PEG-PLA是由聚乙二醇与聚乳酸形成的嵌段共聚物，其通式为PEGm-PLAn，其中m表示PEG链段的数均分子量，m可以为2000，5000或10000；n表示PLA链段的数均分子量，n可以为5000或10000。本发明专利技术涉及HBV基因来源的CpG(HBV-CpG)在纳米材料PEG-PLA的包被下既可以用于制备乙肝预防性疫苗，也可用于制备乙肝治疗性疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及两条来源于HBV基因组的CpG寡核苷酸序列(HBV-CpG)，本专利技术还涉及由纳米材料PEG-PLA包被HBV-CpG制得的纳米颗粒，本专利技术还涉及纳米材料PEG-PLA包被的HBV-CpG运用于乙肝的预防和/或治疗。
技术介绍
慢性乙型肝炎病毒感染是危害全球人类健康的难题，目前全球至少有3.6亿乙型肝炎病毒(HBV)携带者，而其中有超过三分之一人群在中国。现有的乙肝表面抗原疫苗(HBsAg)通过诱导体液免疫应答作为预防性疫苗使用，但是仍然有约10%的疫苗接种者不能产生保护性抗体，而且疫苗对慢性乙肝患者是无治疗效果的。现有的抗乙肝药物如干扰素和拉米夫定可以抑制病毒复制和减轻肝脏损伤，但是由于病毒cccDNA(共价互补环状DNA)的持续存在以及免疫应答缺陷导致最终并不能达到彻底清除乙肝病毒的目的，并且一部分患者对于现有的抗病毒药物治疗无应答。因此发展更为有效的抗病毒药物是迫切需要的。HBV是一种善于免疫逃逸的病毒，HBV感染早期不引起包括I型干扰素(IFN)在内的强烈天然免疫应答表达，那么诱导特异性免疫应答来治疗慢性乙型肝炎显得尤为重要。已有大量的文献表明细菌DNA的非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(cytosinephosphate-guanosine, CpG)的序列能够活化免疫应答特别是Thl型免疫应答，CpG DNA能被模式识别受体9 (Toll-like receptor 9，TLR9)识别。TLR9在人体中表达在浆细胞样DC(plasmacytoid dendritic cells, pDC)细胞和B细胞中。而pDC是已知的重要的表达IFN的细胞。非甲基化的CpG 序列和TLR9的相互作用必然会诱导免疫级联反应包括增强抗原呈递以及诱导I型干扰素等细胞因子。以往的研究结果表明CpG ODN广泛应用于肿瘤、传染性疾病和过敏性疾病的免疫治疗。一些研究显示CpG ODN作为佐剂可以应用于乙肝的预防和治疗，但是已有的CpG ODN治疗乙肝的研究并都未能达到彻底地清除乙肝的效果，同时过强的毒副效应限制了其应用。聚乳酸(PLA)是一类合成的可生物降解的聚合物，已被美国FDA批准用于组织工程、医用材料、药物载体等，但是由于PLA因疏水性较强而不利于难溶性药物的释放，对极性药物的载药率低，因而其应用受到限制。研究者利用聚乙二醇(PEG)对PLA化学结构进行修饰，形成PEG-PLA嵌段共聚物。已有的研究显示(PEG-PLA)纳米颗粒具有可生物降解性、良好的生物相容性以及两亲性的特点，作为微粒给药系统的载体材料可以增强载药量、靶向给药系统、降低突释效应、提高药物在血液中的循环时间、提高生物利用度等优势。因此PEG-PLA微球纳米粒作为新型微粒给药系统有着广阔的发展和应用前景
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供来源于HBV基因组的CpG寡核苷酸序列，即HBV-CpG，所述寡核苷酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。本专利技术的再一个目的是提供由纳米材料(PEG-PLA)包被的HBV-CpG，即形成一种纳米颗粒，表示为NP (HBV-CpG)。本专利技术的又一个目的是提供纳米材料PEG-PLA包被的HBV-CpG在乙肝预防和/或治疗中的应用。本专利技术的又一个目的是提供纳米材料PEG-PLA包被的HBV-CpG在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的试剂盒中的应用。本专利技术的又一个目的是提供一种用于预防和/或治疗乙型肝炎的试剂盒，所述试剂盒包含乙型肝炎疫苗和本专利技术的由纳米材料PEG-PLA包被的HBV-CpG ( S卩，本专利技术的纳米颗粒(NP(HBV-CpG)))。其中所述乙型肝炎疫苗即为目前常规应用的乙型肝炎疫苗。本专利技术的第 一个方面提供具有诱导a干扰素(IFN-α )表达功能的HBV-CpG。本专利技术人通过基因比对设计了一系列来自HBV基因的CpG序列(HBV-CpG)。通过将这些HBV-CpG候选子分别与人外周血单核细胞(PBMC)共同孵育，ELISA检测上清IFN-a的表达，本专利技术人最终筛选到两条具有较高活性诱导IFN-a的HBV-CpG(即，下表I中的Al和B3):HBV-CpG(Al)序列为:5，-GGgacgtcctttgtttacgGGG-3’ (SEQ ID NO:1)HBV-CpG(B3)序列为:5，-GGgagtctagactcgGGGGG-3’ (SEQ ID NO:2)(其中，核苷酸大写表示硫代磷酸化修饰)。本专利技术的第二个方面涉及由纳米材料PEG-PLA包被HBV-CpG制得的纳米颗粒。其中所用的纳米材料PEG-PLA表示聚乙二醇(PEG)与聚乳酸(PLA)形成的嵌段共聚物，其通式为PEGm-PLAn，其中m表示PEG链段的数均分子量，m可以为2000,5000或10000 ；n表示PLA链段的数均分子量，η可以为5000或10000。优选地，m为5000，并且η为10000，即，用纳米材料PEG5_-PLA1Q_包被本专利技术第一方面的HBV-CpG。所述纳米材料与第一方面的HBV-CpG的质量比例在50: 3-50: I范围内，优选为 50: I。所述纳米材料与第一方面的HBV-CpG包被后得到的纳米颗粒NP (HBV-CpG)的粒度在50 200纳米效果较佳。在一个优选的实施方案中，采用PEG5cicic1-PLAiwcici为主要原纳米材料，辅以阳离子脂质(lmg BHEM-Chol)混合后包被本专利技术第一方面的HBV-CpG，在探头式超声波破碎仪中超声乳化(超声的条件:输出功率80瓦，采用超声10秒暂停2秒的频率超声2分钟)，有机溶剂(氯仿)挥发后收集样品，制备得到的纳米颗粒中包含本专利技术筛选的HBV-CpG(纳米材料PEG圆-PLA1q_与HBV-CpG的质量比例范围是50: 3-50: 1，优选50: I)。本领域技术人员应该理解，纳米材料PEG-PLA包被本专利技术的寡核苷酸序列HBV-CpG可以按照常规方法进行。 将纳米材料PEG-PLA包被的HBV-CpG命名为NP (HBV-CpG)，纳米材料PEG-PLA空载体以NPs命名。本专利技术的第三个方面涉及纳米材料PEG-PLA包被的HBV-CpG协同增强乙肝疫苗抗体应答的应用。将目前所用的乙肝疫苗HBsAg单独使用或分别联合NP(HBV-CpG)或NPs免疫BALB/C小鼠，皮下免疫途径，每周一次，连续免疫三次，免疫后第二和第四周分别尾静脉采血,放免法(RIA)检测血清中抗-HBs IgG的表达水平，间接ELISA法检测血清中抗-HBsIgGl和抗-HBs IgG2a的表达水平。NP(HBV-CpG)在BALB/C小鼠体内具有增强抗-HBs IgG应答的能力，更为重要的是，NP(HBV-CpG)具有更强的诱导Thl依赖的抗体亚型IgG2a的能力。由此可见，NP(HBV-CpG)协同增强乙肝疫苗抗体应答，特别是Thl型抗体免疫应答。本专利技术的第四个方面涉及NP (HBV-CpG)联合HBsAg能够治疗HBV的应用。治疗方案如下:HBV携带小鼠连续治疗三周，每周NP(HBV-CpG)连续三天尾静脉给药，第四天NP(HBV-CpG) (lmg NPs:20u g HBV-CpG)联合 2yg HBsAg 皮下给药。治疗第二周开始，NP (HBV-Cp本文档来自技高网...
【技术保护点】
能够诱导α干扰素表达的HBV?CpG寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1或2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏海明，吕树娟，田志刚，王均，孙汭，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：
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