本发明专利技术提供柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因PvNHX1的cDNA，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术还提供克隆权利要求1所述柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因PvNHX1的cDNA的方法，具体步骤为：（1）提取柳枝稷总RNA，反转录成cDNA；（2）以cDNA为模板，以PvNHX1基因全长特异性引物对进行高保真全长PCR反应；（3）回收和纯化步骤（2）的PCR产物，并进行加A反应，得到柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因PvNHX1的cDNA。本发明专利技术获得了柳枝稷PvNHX1基因全长cDNA序列的方法，为以后利用该序列进行构建载体、遗传转化等奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因 PvNHXI的cDNA及其克隆方法。
技术介绍
柳枝稷起源于北美，是多年生C4草本植物。它适应性强、产量高、耐瘠薄，是最具 发展潜力的能源作物之一。据我国当前国情，发展能源植物应以边际土地为主，柳枝稷有限 的耐盐能力限制了其栽种范围，因此筛选出高抗逆的品种具有重要意义。柳枝稷是多倍体， 且两个生态型之间遗传差异较大，因此从宏观上进行品种筛选异常复杂。拟解决的方法是 从柳枝稷中分离克隆耐盐相关基因并对其进行功能分析，通过基因工程技术对基因进行改 造，使其在受体植物中实现超表达，获得耐盐新品种，进而为柳枝稷在边际土地的大面积种 植奠定基础。 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白以液泡膜上的H+-ATPase和H+-PPase建立的跨膜质 子梯度为驱动力，将Na+区隔化进液泡，以减轻其对其他细胞器的毒害，这是植物抵御盐分 胁迫的一种主要方式，在植物的耐盐机制中起重要作用。NHX1基因是编码液泡膜Na+/H+逆 向转运蛋白的关键基因，利用生物技术手段调控该基因可有效提高植物的耐盐性。随着对 植物耐盐分子机制的深入，过表达NHX1基因已在拟南芥、油菜、小麦、玉米、棉花等高等植 物上得到广泛应用并取得较好成果。克隆该基因是实验的前提。目前，已经克隆的植物液 泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因有拟南芥的AtNHXl、小麦的TaNHXl、水稻的OsNHXl、玉米的 ZmNHX1、油菜的BnNHX1、番茄的LeNHX1、柑橘的CNHX1、盐地碱蓬的SsNHX1、北滨藜的AgNHX1 等。然而，到目前为止液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的研究在柳枝稷中仍未见报道，不利 于柳枝稷载体构建、表达调控及遗传转化的研究。
技术实现思路
为进一步研究柳枝稷泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的分子机理，本专利技术的目的是 提供柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因PvNHXI的cDNA及其克隆方法。 本专利技术利用同源克隆和RACE方法，克隆了柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基 因PvNHXI，包含完整的开放阅读框（0RF)及非编码区（UTR)，填补了该基因在柳枝稷中无相 关报道的空白。专利技术人结合同源克隆和RACE克隆技术，分别获得带有重叠部分序列的柳枝 稷PvNHXI基因片段和cDNA的末端序列，序列拼接后获得该基因的cDNA，最后根据拼接序列 设计全长引物进行高保真反应，对所得序列进行进一步验证，为今后开展基因表达、遗传转 化、功能验证等研究奠定基础。 本专利技术研究克隆柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因PvNHXI的cDNA的方法的 具体历程如下： (1)提取柳枝稷的总RNA，反转录成cDNA; (2)以cDNA为模板，以特异性引物对1扩增柳枝稷PvNHXl基因核心片段； (3)将步骤（2)获得的柳枝稷PvNHXl基因核心片段以特异引物对2进行延伸；将 延伸后的柳枝稷PvNHXl基因核心片段以特异性引物GSP2进行cDNA3'末端的克隆，获得 3, cDNA ; (4)将步骤（2)获得的柳枝稷PvNHXl基因核心片段以特异引物对3进行延伸；将 延伸后的柳枝稷PvNHXl基因核心片段以特异性引物GSP1进行cDNA5'末端的克隆，获得 5,cDNA; (5)将获得的步骤（2)获得的柳枝稷PvNHXl基因核心片段、步骤（3)获得的 3'cDNA、步骤（4)获得的5'cDNA进行拼接，得到柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因PvNHXl的cDNA全长，具有SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列，全长1739bp，其中包括完整的 开放阅读框1611bp，编码的多肽含546个氨基酸，且具有高度保守的氨氯吡嗪脒结合位点 (FFHLLPPI)。以此为依据设计获得PvNHXl基因全长特异性引物对。 其中，步骤（2)所述特异性引物对1为：正向引物：5'ACATCCTCGTCTTCAGCG3'（如 SEQIDNo.2 所示）反向引物：5'CTCATCAGTCCAGCCCAC3'（如 SEQIDNo. 3 所示）。 其中，步骤（3)所述特异性引物对2为：正向引物：5'AITGATGTAGCCGTCGTG3'（如SEQIDNo.4 所示）反向引物：5'CTGCTCGGTGGGTGAT3'（如SEQIDNo.5 所示）。 其中，步骤（3)所述特异性引物GSP2为： 5'TCACCAGCACAATCACTGTCGTCCT3'（如SEQIDNo. 6 所示）。 其中，步骤（4)所述特异性引物对3为：正向引物：5'CGTGGTGGCGCACCTGGT3'（如 SEQIDNo.7 所示） 反向引物：5'TGCAGAAAAGATCGCTCC3'（如 SEQIDNo. 8 所示）。 其中，步骤（4)所述特异性引物GSP1为： 5,TGGTCGGAGGTGGAGCCCAGCACGCCC3'（如SEQIDNo. 9 所示）。 其中，步骤（5)获得的PvNHXl基因全长特异性引物对为：正向引物：5'ATGGGGCTCGGCGTGGTGGC3'（如SEQIDNo.10所示）反向引物：5'TCACCGTCCACTCTGCTCGGTGGGT'（如SEQIDNo. 11所示）。 且经验证，获得的PvNHXl基因全长特异性引物对能克隆获得的柳枝稷液泡膜Na+/ H+逆向转运蛋白基因PvNHXl的cDNA，开放阅读框1611bp，序列如SEQ ID No. 12所示，编码 的多肽含546个氨基酸，且具有高度保守的氨氯吡嗪脒结合位点（FFIYLLPPI)，与拼接完成 的PvNHXl基因一致。 本专利技术提供的柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因PvNHXl的cDNA具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。 本专利技术提供的克隆柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因PvNHXl的cDNA的方 法，具体步骤为： (1)提取柳枝稷总RNA，反转录成cDNA; (2)以cDNA为模板，以PvNHXl基因全长特异性引物对进行高保真全长PCR反应； (3)回收和纯化步骤（2)的PCR产物，并进行加A反应，得到柳枝稷液泡膜Na+/H+ 逆向转运蛋白基因PvNHXl的cDNA; 所述PvNHXl基因全长特异性引物对为：正向引物：5'ATGGGGCTCGGCGTGGTGGC3'（如SEQIDNo. 10 所示）反向引物：5'TCACCGTCCACTCTGCTCGGTGGGT'（如SEQIDNo. 11 所示）。 其中，步骤（1)所述反转录的反应条件为37°C孵育60min;反应体系为：【主权项】1. 柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因 PvNHXl的cDNA，其特征在于，核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。2. 克隆权利要求1所述柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因 PvNHXl的cDNA的方 法，其特征在于，具体步骤为： (1) 提取柳枝稷总RNA，反转录成cDNA ; (2) 以cDNA为模板，以PvNHXl基因全长特异性引物对进行高保真全长PCR反应； (3) 回收和纯化步骤（2)的PCR产物，并进行加 A反应，得到柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向 转运蛋白基因 PvNHX本文档来自技高网...
【技术保护点】
柳枝稷液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因PvNHX1的cDNA，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张蕴薇，黄艳华，杨富裕，刘斯佳，杜娟，路海博，孙元元，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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