本发明专利技术公开了进行聚合酶链式反应(PCR)和熔解分析以确定拷贝数变异和/或基因表达的方法和试剂盒。本发明专利技术还公开了这些方法和分析的相关应用。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术通常地涉及聚合酶链式反应（PCR)。更具体地，本专利技术涉及限制PCR的方法 和进行熔解分析，以及其这种方法和分析的应用。
技术介绍
脱氧核糖核酸（DNA)拷贝数变异（CNV)与某些遗传性疾病、染色体重排和癌症相 关。 临床实验室通常用于检测CNV的标准方法是荧光原位杂交（FISH) 。FISH 的分辨率是约100千碱基对（kb)，但是包含较短片段的CNVs很难用这种方法检测。在人类 基因组序列完成后的近十年中，一些能够解决更短CNVs的分子检测技术已经显示了 存在于正常个体中的结构变异的显著水平。 在上个十年中发展的最流行的技术有阵列比较基因组杂交（CGH)、阵列单核苷酸 多态性（SNP)、实时定量PCR(qPCR)和多重连接探针扩增（MLPA)以及大规模平行测序。基 于阵列的技术（阵列CGH和阵列SNP)足以用于人类全基因组变异的全球和高分辨率的扫 描。靶向于阵列的高密度分辨率已经接近了一些碱基对。在最近几年中，新一代测 序技术已经用于CNV检测。上述方法耗时多并且需要费用较高的设备和试剂。 实时qPCR可以根据跨越循环数目的阈值变化用于计算CNVs ( Δ Δ Cq) 。这 个方法迅速且不需要昂贵的设备。从人类基因组一般观察到的拷贝数变异比率可以是10 : 1或者更高，或者小至4 :3。三体综合征（trisomy)(如：唐氏综合征）涉及的3 :2的比率 是特别常见的。理论上，qPCR可以用于检测2 :1的CNV和甚至三体性，但是在实践中为了 获得可信赖的结果需要极大的关注，并且通过qPCR识别较小的比率是非常困难的。qPCR - 般用于基因表达，然而，对于拷贝数的确定，qPCR已经在临床上较少应用。 MLPA被广泛应用于在临床实验室中检测遗传性疾病相关CNVs，因为它能够检 测基因的大量缺失（deletion)和重复（duplication)(特别是外显子的缺失和重复） 。然而，MLPA耗时长并且需要长的定制的寡核苷酸探针。除了实时PCR以外，所有 这些方法需要至少一天完成。 存在确定CNV和确定基因表达的可选择的快速方法的需要。 专利技术概述 在此公开限制性PCR和进行熔解分析的方法。这些方法可以用于各种目的，如确 定遗传拷贝数变异（CNVs)和确定基因的相对表达水平。 例如，在一些【具体实施方式】中，该方法包括在限制扩增中通过聚合酶链反应对遗 传性样品（genetic sample)的感兴趣区域（或位点（locus))进行扩增。该方法可以进一 步包括确定任何产生的扩增子的熔解曲线（melting curve)，然后将熔解曲线与作为参考 的参考曲线进行比较，其中两条曲线之间的不同显示了遗传性样品在感兴趣区域的拷贝数 变异。 在一些【具体实施方式】中的另外一个实施例中，该方法包括在限制扩增中扩增遗传 性样品感兴趣区域并通过聚合酶链反应也扩增参考。该方法可以进一步包括确定感兴趣区 域的熔解曲线和参考的参考曲线，然后将感兴趣区域的熔解峰与参考的熔解峰进行比较， 其中两个峰之间的不同显示了相对拷贝数和表达水平的不同。 还公开了分析PCR熔解温度数据的方法。该方法包括对遗传性样品和参考样品进 行PCR。该方法进一步包括获得未经加工的荧光相对于熔解温度的数据，例如使用光扫描仪 获得。该方法可包括从未经加工的荧光相对于熔解温度的数据中去除背景噪声。该方法可 以进一步包括标准化所有的熔解温度数据，随后标准化参考荧光峰高度以显示遗传性样品 峰的不同。 还提供进行这样方法的试剂盒。【附图说明】 图IA说明用不同浓度的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP)的双倍扩增。 图IB说明图IA表示的双倍扩增的熔解曲线。 图2A说明在第21个循环停止的聚合酶链反应（PCR)扩增。 图2B说明在第24个循环停止的PCR扩增。 图2C说明在第27个循环停止的PCR扩增。 图2D说明在第30个循环停止的PCR扩增。 图2E说明在第33个循环停止的PCR扩增。 图3A说明在标准dNTP浓度下的PCR熔解曲线。 图3B说明在dNTP浓度为100 μ M下的PCR熔解曲线。 图3C说明在dNTP浓度为50 μ M下的PCR熔解曲线。 图3D说明在dNTP浓度为25 μ M下的PCR熔解曲线。 图3Ε说明在dNTP浓度为12. 5 μ M下的PCR熔解曲线。 图3F说明在dNTP浓度为6. 25 μ M下的PCR熔解曲线。 图3G说明在dNTP浓度为3. 125 μ M下的PCR熔解曲线。 图3Η说明在dNTP浓度为1. 56 μ M下的PCR熔解曲线。 图4Α说明在10倍不同浓度的初始样品的PCR扩增。 图4Β说明使用本文公开方法的一种【具体实施方式】的图IA中扩增子的熔解曲线。 图5Α说明在标准聚合酶浓度下的PCR熔解曲线。 图5Β说明在聚合酶浓度为0. 2U/ μ L下的PCR熔解曲线。 图5C说明在聚合酶浓度为0.1 U/ μ L下的PCR熔解曲线。 图说明在聚合酶浓度为0. . 05U/ μ L下的PCR熔解曲线。 图6Α说明使用本文公开方法的一种【具体实施方式】的13-三体综合征样品的盲测 概况。 图6Β说明使用本文公开方法的一种【具体实施方式】分析18-三体综合征样品的盲 测概况。 图6C说明使用本文公开方法的一种【具体实施方式】分析21-三体综合征样品的盲 测概况。 图7说明使用本文公开方法的一种【具体实施方式】分析性染色体的盲测摘概况。 图8说明使用本文公开方法的一种【具体实施方式】分析杂合缺失（heterozygous deletions)〇 图9说明使用本文公开方法的一种【具体实施方式】和不饱和染料分析拷贝数变异。 图10列出了本文大部分实施例使用的引物。碱基对的大小和Tm描述了产生的扩 增子。 图11说明使用本文公开方法的一种【具体实施方式】分析癌症样品的拷贝数变异。 图12说明使用本文公开方法的一种【具体实施方式】的样品的定量结果。 图13说明通过在此公开方法和常规定量PCR两种【具体实施方式】确定相对基因表 达的相关性。 图14说明通过本文公开方法的一种【具体实施方式】分析相对基因表达。 图15A说明用IO4拷贝数扩增具有不同浓度的dNTPs人类基因组DNA的稀释系列 质粒 DNA(10nto 101)。 图15B与图15A类似，除了显示的是2X稀释系列（22°to 29)和用214拷贝数混合 人类基因 DNA。 图16A是相对峰高度对拷贝数比率做图，其中CXCL9扩增子以IO11到10 1拷贝提 供，并且用小鼠 β-肌动蛋白cDNA作为参考基因 （reference gene)的IO4拷贝扩增。25 μΜ dNTPs用于每一反应中。 图16B说明通过qPCR方法和通过相对峰高度确定的拷贝数之间的相关性。在qPCR 方法中，小鼠 cDNA β -肌动蛋白参考基因和目标基因 CXCL9通过qPCR被分别扩增。β -肌 动蛋白和CXCL9的Cq被用于计算CXCL9的拷贝数。根据图16Α的公式来计算通过熔解峰 确定的CXCL9。 图17Α显示单个等位基因扩增以确定SMAl基因的拷贝数。图17Β与图17Α相似， 但是表示的是单个等位基因扩增以确定SMA2基因的拷贝数。 专利技术详述 拷贝数变异（CNV本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种确定核酸样品中拷贝数变异(CNV)的方法，该方法包括：扩增核酸样品的感兴趣区域，同时限制感兴趣区域的扩增；确定扩增步骤生成的扩增子的熔解曲线；和将所述熔解曲线与参考核酸的参考曲线进行比较，其中两条曲线的不同显示了拷贝数变异的存在。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·威特沃，周路明，R·帕莱斯，
申请(专利权)人：C·威特沃，周路明，R·帕莱斯，
类型：发明
国别省市：美国;US
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